【摘要】 目的：探讨重组胸腺素β4(Thymosin β4, Tβ4)对角膜碱烧伤后角膜核转录因子κB(nuclear factor κB,NFκB)表达的影响和促进角膜愈合的观察。方法：用1mol/L NaOH浸透的6mm直径圆滤纸片贴于兔角膜中央30s，建立兔角膜碱烧伤模型。动物随机分为实验组和对照组，实验组给予低中高剂量(0.1,1,10μg/50μL)Tβ4，对照组给予PBS(阴性对照组)和rhEGF(阳性对照组)皆2次/d滴眼。烧伤后1, 3, 7, 14d肉眼观察角膜烧伤面积的变化，照相、统计愈合率;免疫组化染色检测NFκB和IL1β表达;取烧伤区角膜组织匀浆液提取细胞核蛋白，用ELISA检测NFκB的p65亚基表达水平。结果：角膜碱烧伤后Tβ4用药组角膜愈合率最高达到33.8%，相应阴性对照组为22.8%，Tβ4用药组显著高于对照组(P<0.01)，其中中剂量Tβ4组愈合率高于其他剂量组;Tβ4用药组NFκB免疫组化染色积分吸光度明显低于对照组(P<0.05)，ELISA检测NFκB的p65亚基，在Tβ4用药组中表达最少(P<0.01)，IL1β免疫组化染色阳性，但实验组和对照组差异无统计学意义。结论：重组Tβ4促进角膜碱烧伤修复，其机制可能与下调NFκB在细胞核内的表达相关。
【关键词】 碱烧伤;创伤愈合;胸腺素β4;基质金属蛋白酶2;血管内皮生长因子
Recombinant Thymosin β4 regulate corneal nuclear factor κB expression after rabbit corneal alkali injury
AnHua Long, Ming Li, XiaoKun Wang, Wen Si, XuanDe Li, LiYa Nie, SuYong Ma,YongZhe Che, SongShan Xu
Foundation item: Nankai University 100 Project Foundation (No. BX6248)
1Key Laboratory of Bioactive Materials, Ministry of Education, Medical College of Nankai University, Tianjin 300071, China; 2Beijing Nuosilande Biotechnology Co., Ltd. Beijing 100085,China
Correspondence to:YongZhe Che. Key Laboratory of Bioactive Materials, Ministry of Education, Medical College of Nankai University, Tianjin 300071, [email protected]
AbstractAIM: To investigate the ability of Thymosin β4 (Tβ4) to promote healing in an alkali injury model in vivo and the mechanisms involved in that process which Tβ4 may be a potential antiinflammation agent in this model. METHODS: Corneas of the NewZealand Rabbit were chemically burned with a 6mm disc soaked in 1mol/L NaOH for 30 seconds. Eyes were irrigated copiously with saline and then treated topically with PBS(Negative control group), rhEGF(jinyinshu drop, Positive control group), and Tβ4 (0.1, 1, 10μg/50μL) twice daily. At the time point of 1 day, 3, 7, 14 days postburn, the healing rate of the cornea were examined and MMP2, TIMP2, VEGF immunostaining performed.RESULTS:Tβ4treated corneas demonstrated improved cornea healing rate of 33.8% vs PBStreated corneas of 22.8%(P<0.01) , 1μg/50μL Tβ4 seemed to be the best dosage. Whereas immunohistochemistry result suggested that Tβ4 decreased corneal NFκB expression(P<0.01) after alkali injury, no change in IL( interleukin) 1β was detected(P>0.05). The enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) result suggested that theres a significant decrease to the NFκB protein levels(P<0.01). CONCLUSION: Tβ4 treatment decreases corneal inflammation and inhibits the expression of NFκB to improve cornea healing. The result have important clinical implications for the potential role of Tβ4 as a corneal antiinflammatory agent.
KEYWORDS: alkali injury; wound healing; Thymosin beta4; nuclear factorkappa B; interleukin1β
0引言
角膜碱烧伤是一种严重的角膜损伤。研究显示，角膜碱烧伤后许多促炎因子和细胞趋化因子表达增加[1],这些促炎因子表达的增加导致角膜损伤部位白细胞和单核细胞浸润，组织破坏和溶解作用会导致角膜愈合的延迟。TNFα和IL1β是非常重要的调节炎症程度的细胞因子，它们在感染、组织损伤、恶性肿瘤和细胞凋亡等过程中通过启动炎症反应来抵抗外来物入侵[2]，但失控的炎症反应往往导致组织自身损伤，不利于组织愈合[3]。Tβ4是G肌动蛋白偶联蛋白，最近研究表明Tβ4能够调节肌动蛋白平衡，促进多种细胞迁移[4,5]，抑制炎症过度表达[6]，抑制细胞凋亡[7]等;在促进皮肤创伤愈合[8]，保护和修复心肌，促进角膜碱烧伤后修复[9]以及促进毛囊干细胞生长等方面具有很好的促进和调节作用。近年来研究显示Tβ4和其变异体Sulfoxide Tβ4，splicevariant Tβ4均有抑制炎症因子和促进组织创伤愈合的作用[10,11]。Tβ4在大鼠角膜清创术后能调节IL1和IL8表达并促进角膜再上皮化和角膜愈合，促炎因子TNFα和IL1β可以激活NFκB，NFκB是Rel家族的同源蛋白，最重要的两个亚基是p65和p50，被激活后以二聚体形式转位至细胞核内发挥转录因子活性，与细胞炎症过程密切相关。在角膜碱烧伤中NFκB的抑制剂SN50能加速角膜上皮细胞增殖促进角膜愈合[12]，Sosne等[6]首次报道Tβ4具有对NFκB的抑制作用，可以调节角膜碱烧伤后炎症反应的程度，是Tβ4促角膜修复的可能机制。我们观察Tβ4促进角膜碱烧伤后角膜愈合的情况下，并探讨Tβ4是否通过调节NFκB的机制发挥其抗炎作用。
1材料和方法
1.1材料
健康成年新西兰白兔(军事医学科学院实验动物中心提供)，2.0～3.0kg，雌雄不限。60只动物随机分为实验组和对照组，实验组又分低剂量(0.1μg )、中剂量(1μg)、高剂量(10μg)组，对照组分为PBS阴性对照组和rhEGF阳性对照组，每组12只，分别在1,3,7,14d各处死3只，快速取材完整兔角膜。重组Tβ4由北京诺思兰德生物技术有限公司提供，rhEGF滴眼液商品名为“金因舒”，由深圳市华生元基因工程发展有限公司生产(国药准字S20040006)，抗兔IL1β一抗由武汉博士德生物工程有限公司提供，抗兔NFκB一抗由santa cruz Biotechnology, Inc提供，过氧化物酶和二抗等免疫组化试剂以及ELISA试剂盒均由天津灏洋生物制品科技有限公司提供。
1.2方法
1.2.1兔角膜碱烧伤模型制作
实验动物用20g/L利多卡因2mL局部浸润麻醉，自制开睑器开睑，用在40g/L NaOH浸透的直径为6 mm的圆滤纸片贴于两眼角膜中央，30s后迅速用无菌生理盐水冲洗5min，建立角膜碱烧伤模型。每天分别用3种剂量的Tβ4、无菌PBS和rhEGF滴眼液早晚两次滴眼。分别在1,3,7,14d取材，部分组织迅速固定于40g/L多聚甲醛固定液24h，经常规石蜡包埋，行水平连续切片(5μm)，部分组织迅速冷冻备用。
1.2.2角膜愈合率检测
对14d取材的实验动物，角膜碱烧伤后每隔1d拍照角膜烧伤部位，Motic 3.0计算角膜愈合率,角膜愈合率=(1取材时角膜损伤面积/原始角膜损伤面积)×100%。
1.2.3 NFκB和IL1β表达的检测
每个角膜标本取1张切片行HE染色，观察组织学形态。再各取1张行NFκB和IL1β免疫组化染色，一抗(1∶50)4℃孵育过夜，相应的生物素标记的二抗(1∶200)室温45min，SP复合物室温孵育45 min，DAB显色，显微镜下控制并严格控制各组的反应时间，Mayer苏木精对比染色1min，常规封片。显微镜(Leica DM RXA2)观察并取角膜中央和角膜缘各3张图片，用于图像分析。
1.2.4细胞核内NFκB蛋白水平的检测
在各时间点取角膜组织后立即冷冻于70℃，液氮冷冻条件下研磨组织，再分别用自配胞质裂解液和胞核裂解液抽提胞质蛋白和胞核蛋白，胞核蛋白用于ELISA检测NFκB蛋白的p65亚基表达情况，操作均按试剂盒说明步骤进行。
统计学分析:对免疫组化染色的切片每组动物各取5张，显微镜照相取图时按照两角膜缘和损伤中央部位各取3张图，用Motic 3.0图像分析软件分析平均积分吸光度(IOD/Area)，行两因素方差分析(Two way ANOVA)和Dunnettt检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1烧伤愈合率
碱烧伤后11d时阴性对照和阳性对照组角膜愈合率分别为22.7%和21.4%，Tβ4用药组愈合率分别为22.2%，27.7%和33.8%，明显高于PBS阴性对照组(P<0.01或P<0.05);Tβ4三个剂量组中中剂量组在3，5，7和9d时间点均高于其它剂量组，但差异无统计学意义(图1)。
2.2 NFκB和IL1β的表达
在烧伤后1和3d角膜上皮、内皮细胞胞质均为阳性，均匀分布，阳性部位以上皮细胞基底膜层和角膜边缘上皮最为明显，经平均积分光密度分析，Tβ4用药组和对照组阳性强度无统计学差异;7d各组染色仍为阳性，但Tβ4用药组染色强度比对照组低(P<0.05);14d Tβ4用药组明显阳性部位比对照组少，染色强度低(P<0.01)。各时间点rhEGF阳性对照组与PBS阴性对照组无差异(P>0.05)。IL1β免疫组化染色结果，靠近基底膜的角膜上皮、内皮层细胞胞质均有强阳性表达，基质层有散在表达的颗粒，但免疫阳性表达弱。平均积分光密度分析，在各个时间点，Tβ4用药组和对照组阳性强度无统计学差异。
2.3细胞核内NFκB水平
ELISA检测角膜细胞核NFκB p65亚基蛋白表达结果如图2，在1d rhEGF阳性对照组和阴性对照组、Tβ4各剂量组之间表达量无差异(P>0.05);3d NFκB在Tβ4用药组中表达显著降低(P<0.01)，而对照组NFκB表达跟1d相比无变化;7d和14d Tβ4用药组比对照组表达低(P<0.01)。但Tβ4各剂量组之间差异没有规律。ELISA检测细胞核内NFκB p65亚基蛋白表达情况与免疫组化结果大致类似，但ELISA结果中NFκB表达下降时间点比免疫组化提前至3d。
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