【摘要】 目的：探讨中药青光安对兔实验性急性高眼压后视网膜组织结构及细胞凋亡的影响。方法：将49只家兔随机分为7组，每组7只。其中A1和A2为青光安组;B1和B2为石斛夜光丸组;C1和C2为模型组;D组为空白对照组。青光安连续灌胃1wk后用前房内灌注生理盐水法制成急性高眼压模型。再连续灌胃1wk和2wk处死动物，用光镜和透射电镜观察视网膜超微结构的变化，光镜观察视网膜细胞凋亡情况。结果：1wk和2wk视网膜组织结构差别不大。模型组和石斛夜光丸组视网膜各层结构紊乱，细胞数量不同程度减少，其凋亡小体数量明显多于青光安组，A组与B，C组比较，差异有非常显著统计学意义(P<0.01)。模型组和石斛夜光丸组的神经节细胞核膜欠清，大多数线粒体肿胀，有固缩现象，粗面内质网扩张;青光安组上述改变不明显。结论：青光安具有保护视网膜组织结构，减少细胞凋亡的作用。
【关键词】 青光安颗粒剂;益气活血利水法;急性高眼压模型;视网膜组织结构;细胞凋亡
Effects of qingguangan on retinal structure and apoptosis in rabbit eyes with acute ocular hypertensionChangXia Dong，Jun Peng，QingHua Peng，ZhiCheng ZengFoundation items:Science Research Foundation Key Project of Education Office of Hunan Province,China(No. 06A052);Science Research Foundation Project of Health Office of Hunan Province,China(No. 204084)1Key Discipline of Ophthalmology，the First Affiliated Hospital of Hunan University of Traditional Chinese Medicine，Changsha 410007，Hunan Province，China;2Department of Ophthalmology，Yantai Yuhuangding Hospital，Affiliated hospital of Medical College of Qingdao University，Yantai 264000，Shandong Province，China; 3Medical School NanHua University，Hengyang 421001, Hunan Province，China;4Department of Ophthalmology Guiyang County People’s Hospital，Guiyang 424400，Hunan Province，ChinaAbstractAIM: To explore the effects of qingguangan on retinal structure and apoptosis in rabbit eyes with acute ocluar hypertension.METHODS: Fortynine rabbits were divided into 7 groups randomly,7 rabbits in each group. Group A1 and A2 belonged qingguangan group.Group B1 and B2 belonged to eyesightimproving bolus of noble dendrobium group.C1 and C2 were model group.Group D was blank control group.After administrated qingguangan intragastrically for one week rabbits were filled normal saline into anterior chamber to make acute ocular hypertension model. Then after rabbits were administrated qingguangan intragastrically for one week and two weeks all were killed. Retinal ulstructure changes were observed in light microscope and transmission electron microscope, while apoptosis was observed in light microscope.RESULTS: Retinal structures were not different in one week and two weeks. Layers of the retina model group and eyesightimproving bolus of noble dendrobium group were disorder and cell numbers decreased . The number of apoptotic bodies of two groups were more than those of qingguangan group. Ganglion nuclear membrane of two groups were less clear. Most of mitochondria were swelling and there was condensation phenomenon, rough endoplasmic reticulum dilation.But changes above mentioned in qingguangan group were not obvious.CONCLUSION: Qingguangan has the effects of protecting retinal structure and reducing apoptosis.
KEYWORDS: qingguanggn granule; method of benefiting qi and activating blood and diuresis; acute ocular hypertension model; retinal structure;apoptosis0引言
青光眼视功能损害的病理基础是视网膜神经节细胞(retinal ganglion cell, RGC)及其纤维的变性、萎缩和丧失，能量代谢障碍和自由基及其代谢产物都是青光眼视功能损害的相关因素，青光眼RGC的死亡方式是凋亡[1，2]。青光眼治疗最终目的是阻止视神经的损害，保护视功能。因此青光眼的理想治疗是既能降低眼压，增加局部血流量，又可预防视网膜神经节细胞的凋亡以及促进损伤的轴突再生。目前，通过手术或药物可成功地控制眼内压，但在青光眼视网膜神经节细胞的保护与再生治疗方面，目前尚无比较公认的有效治疗方法。我们探讨具有益气活血利水功效的中药复方——青光安颗粒剂对实验性急性高眼压模型兔眼视网膜组织结构及细胞凋亡的治疗作用及其机制如下。
1材料和方法
1.1材料
健康成年中国大白兔49只，雌雄各半，体质量2.0～2.5kg，无眼部疾病。医动字号：20003，由湖南中医药大学动物实验中心提供。造模前，Schoitz眼压计测量眼压1.60～2.40kPa。青光安颗粒剂(由黄芪、茯苓、白术、地龙、红花、赤芍等益气活血利水中药按现代制剂工艺制成)，由湖南中医药大学第一附属医院药剂科提供，使用时研粉末，用温开水配制成250g/L混悬液。石斛夜光丸，由浙江天一堂药业公司提供，使用时研粉末，用温开水配制成120g/L混悬液。原位细胞凋亡检测试剂盒，由华美生物工程公司提供。Schiotz眼压计，由苏州医疗器械厂生产;H600透射电镜，由中南大学湘雅医学院电镜室提供;恒温水浴箱、玻璃匀浆器、加液枪，由湖南中医药大学分子生物学实验室提供;光学显微镜、显微摄像机，由湖南中医药大学微生物组织学教研室提供。
1.2方法
取家兔49只，随机分为7组，每组7只。其中A1和A2组为青光安组，用青光安颗粒剂的混悬液2.5g/kg灌胃;B1和B2为石斛组，用石斛夜光丸的混悬液1.2g/kg灌胃;C1和C2为模型组，用相当量的蒸馏水灌胃;D为空白对照组。药物剂量是按照人与动物体表面积等效剂量比率表计算，以成人临床常用剂量的2倍给药， 1次/d。灌胃并用2.5g/L氯霉素滴眼液滴眼，1wk后参照赵桂秋等[3]的方法造模。造模后每天灌胃，并点眼药各1次。A1，B1和C1于术后1wk用空气栓塞法处死，其余4组于术后2wk用空气栓塞法处死。处死后即刻在冰上摘取眼球(1个眼球为1份标本)，在冰环境中环角膜缘切开，弃去眼前节、晶状体和玻璃体，外翻眼球壁。将眼球壁沿矢状轴一分为二剪开，鼻侧1/2用40g/L多聚甲醛固定，作HE染色和TENUL染色观察;颞侧1/2用25g/L戊二醛和10g/L锇酸双固定，作电镜观察。将鼻侧固定的眼球壁按原位细胞凋亡检测的步骤依次灭活、消化修复、标记、显色，最后苏木素复染。常规封片后光镜观察视网膜TUNEL阳性细胞并计数。每一切片被标记的细胞约计数15个高倍镜视野，然后以每10个高倍镜下被标记的平均细胞数来表示。将25g/L戊二醛固定的眼球壁标本作电镜送检。10g/L锇酸后固定1h，梯度丙酮脱水，EPON812环氧树脂浸泡，包埋，切成超薄片，醋酸双氧铀柠檬酸铅电子染色后做透射电镜观察。表1急性高眼压后兔视网膜TUNEL阳性细胞数(略)
统计学分析：所有数据均输入微机，采用SPSS 13.0统计软件包处理，所有数据用±s表示;计量资料进行方差齐性检验后，方差齐者两两比较用q检验，方差不齐者用秩和检验。
2结果
2.1急性高眼压后兔外眼变化情况
造模时A，B，C 3组模型眼均呈现眼球变硬，瞳孔散大，球结膜水肿、充血,角膜水肿、雾状混浊的变化。球结膜水肿、充血在4～5d内消失，角膜水肿均于次日消失。D组眼球未发现明显变化。
2.2病理学变化
急性高眼压后2wk各组视网膜的结构形态要比1wk时要好，但差别不大。空白对照组视网膜结构完整，层次清楚，细胞排列紧密，无空泡。青光安组视网膜结构完整，层次清楚，细胞数量也有不同程度减少和空泡样变，A2和A1组差别不大(图1A)。石斛夜光丸组较青光安组视网膜结构差，层次欠清，细胞数量有较多减少和空泡样变，B2和B1组差别不大(图1B)。模型组视网膜各层结构紊乱，层次不清。视网膜各层细胞尤其是节细胞数量锐减，细胞排列疏松，可见大量水泡和变性组织。C2与C1组差别不大(图1C)。
2.3细胞凋亡检测
空白对照组视网膜结构完整，三层细胞层次清楚;未发现明显呈棕黄色的TUNEL阳性细胞。青光安组仅极个别眼球发现视网膜细胞呈均匀的淡染色，未发现明显的TUNEL阳性细胞(图2A)。石斛夜光丸治疗组可发现较多TUNEL阳性细胞(图2B)。模型组视网膜各层细胞(外核层、内核层、神经节细胞层)均可见较多的TUNEL阳性细胞，尤其以外核层较多(图2C)。C2与C1组相比，TUNEL阳性细胞数有所减少，差异具有显著性(P<0.05，表1);A2与A1组相比，B2与B1组相比，TUNEL阳性细胞数差别无统计学意义;同一试验点，模型组与石斛夜光丸治疗组的TUNEL阳性细胞数均明显高于青光安组(P<0.01)。说明与石斛夜光丸相比，青光安组具有明显的保护视网膜的作用。
2.4超微结构变化
空白对照组神经节细胞呈圆形或卵圆形，核膜清晰，染色质分布均匀，核仁明显。线粒体、粗面内质网丰富，结构正常;双极细胞超微结构正常。A1和A2组差别不大，大多数神经节细胞呈卵圆形或圆形，核膜欠清，染色质分布均匀，核仁明显。大多数线粒体嵴清晰，粗面内质网基本正常;双极细胞核膜欠清，线粒体改变不明显(图3A)。B1和B2组神经节细胞结构较模糊，核膜不清晰，整个细胞电子密度略有增高，线粒体轻微固缩，粗面内质网基本正常。模型组大多数神经节细胞核膜不清晰，部分细胞核扭曲，线粒体肿胀，嵴消失。双极细胞内线粒体肿胀，嵴消失，空泡样变，粗面内质网轻微扩张(图3B，C)。
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