【摘要】 目的：验证体外重建组织工程人角膜内皮（TEHCE）在角膜内皮移植中的作用。方法：以非转染人角膜内皮细胞（HCE细胞）为种子细胞，以去上皮层修饰羊膜为载体支架体外重建的TEHCE，经CMDiI标记后对撕除内皮层和后弹力层（DM）的新西兰兔进行了兔穿透性角膜内皮移植。用裂隙灯显微镜观察移植眼角膜的透明度。用荧光显微镜观察种子细胞荧光标记。用茜素红染色和冰冻切片HE染色和扫描电镜观察种子细胞的形态、细胞连接的形成情况、细胞单层的完整性及其与DM结合的紧密程度。用透射电镜方法鉴定种子细胞、DM和角膜的超微结构。结果：TEHCE可使新西兰兔角膜保持透明39d以上。角膜内皮层移植区的细胞均带有CMDiI荧光标记。绝大多数种子细胞为六角形，细胞间连接紧密，重建出了完整的角膜内皮层，且内皮层与DM结合紧密。种子细胞重建出了连续的角膜内皮层，种子细胞、DM和角膜的形态结构与正常对照眼的几乎相同。结论：移植后的TEHCE在种子细胞形态、连续单层状态、细胞连接形成及超微结构上均与对照兔眼的角膜内皮类似，使移植新西兰兔角膜长期保持透明。
【关键词】 人角膜内皮细胞；去上皮层修饰羊膜；组织工程人角膜内皮；新西兰兔；角膜内皮移植
Functional studies of tissueengineered human corneal endothelium by corneal endothelial transplantation in New Zealand white rabbits
TingJun Fan, Jun Zhao, Jing Wang, RiShan Cong, XiuXia Yang, WeiYun Shi, YiQiang Wang
Foundation items: National High Technology Research and Development Program ("863" Program) of China (No.2006A A02A132); Opening Program from The State Key Laboratory Cultivation Base, Shandong Provincial Key Laboratory of Ophthalmology (No.2006K05)
Laboratory for Corneal Tissue Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266003, Shandong Province, China;Shandong Eye Institute, Shandong Academy of Medical Sciences, Qingdao 266071, Shandong Province, China
Abstract
AIM: To investigate biological functions of in vitro reconstructed tissueengineered human corneal endothelia (TEHCE) by animal corneal endothelium transplantation.
METHODS: TEHCEs, reconstructed by using untransfected human corneal endothelialcells (HCE cells, labeled with CMDiI) as seed cells and modified denuded amniotic membrane (mdAM) as scaffold carriers, were used for penetrating corneal endothelium transplantation in New Zealand white rabbits whose corneal endothelium along with Descemet's membrane (DM) was ripped off before transplantation. The corneal transparency was monitored with a slitlamp biomicroscope, and the CMDiI label of seed cells was checked with a fluorescent microscope. The morphology of seed cells, formation of cell junctions, integrality of endothelial monolayer and its integrated status to DM were investigated by Alizarin red staining, freezesections hematoxylineosin (HE) staining and scanning electron microscopy. The ultrastructure of seed cells, DM and corneas were examined by transmission electron microscopy.
RESULTS: Slitlamp biomicroscopic observation of transplanted eyes showed that the TEHCEs could maintain corneal transparency of the transplanted New Zealand white rabbits for more than 39 days. Fluorescent observations showed that all the seed cells in the transplanted area had positive CMDiI labels. Alizarin red staining, freezesection's HE staining and scanning electron microscopic detections showed that most of seed cells were in hexagonal morphology, integral endothelial monolayer was reconstructed with tight intercellular junctions, and endothelial monolayer integrated tightly to DM, secreted from seed cells. Transmission electron microscopic examination showed that a continuous endothelial monolayer was reconstructed by transplanted TEHCE, and the ultrastructures of seed cells, DM and corneas were almost the same with those from control eyes.
CONCLUSION: The cell morphology, status of continuous monolayer, cell junction and ultrastructure of transplanted TEHCEs are almost the same with those of rabbit corneal endothelia from control eyes. The TEHCEs, with similar structures and functions to those of rabbit corneal endothelia, have abilities of maintaining long term cornea transparency of New Zealand white rabbits, and may be used promisingly as HCE equivalents for clinical corneal endothelium transplantation.
KEYWORDS: human corneal endothelial cell; modified denuded amniotic membrane; tissueengineered human corneal endothelium; New Zealand white rabbit; corneal endothelium transplantation
0引言
完整的单层人角膜内皮（human corneal endothelium,HCE）细胞是维持角膜正常厚度和透明度的关键。成人HCE细胞几乎没有增殖能力，局部细胞损伤后只能依靠邻近细胞扩张和移行来填补缺损区，一旦HCE细胞的密度低于维持角膜内皮生理功能之临界密度后就会引起不可逆病变，即角膜内皮盲。患者绝大部分可以通过角膜移植而复明，但由于捐献角膜的数量非常有限，使绝大部分患者因得不到移植角膜而无法复明[1]。近年来，角膜组织工程的兴起为组织工程人角膜内皮（TEHCE）的体外重建和患者通过临床角膜移植而重建光明带来了新的希望[2,3]。目前，重建TEHCE所用的载体支架主要有角膜DM[4]、去上皮层羊膜[5]、以胶原壳聚糖为基础的共混膜[6,7]、聚羟乙基丙烯酸甲酯[8]、无细胞猪角膜基质[9]和N(1甲基乙基)2丙烯酰胺均聚物[10]等。利用这些载体支架和原代培养HCE细胞或仅传4～5代的HCE细胞，分别重建出具有近似角膜内皮结构和部分角膜内皮功能的角膜内皮类似物，为利用载体支架和HCE细胞重建TEHCE开辟了道路，但移植后只能使移植角膜维持透明1wk左右[5,6,1014]。到目前为止，仍未见到重建TEHCE可使移植动物角膜保持透明超过1wk的报道。利用以非转染HCE为种子细胞、以去上皮层修饰羊膜（mdAM）为载体支架体外重建的TEHCE，对撕除后板层（角膜内皮层和DM）的新西兰兔进行了穿透性角膜内皮移植，评估TEHCE的动物角膜移植效果如下。
1材料和方法
1.1材料 无眼疾健康新西兰兔，体质量2.0～2.5kg，雄雌不分，由山东省眼科研究所实验动物中心提供；非转染HCE细胞系单克隆细胞株，由本实验室自行建立的第224代非转染HCE细胞系经有限稀释法克隆化筛选而来；去上皮层修饰羊膜（mdAM）由本实验室利用新鲜羊膜经去上皮层处理和包被修饰制备而成。体外培养的HCE单克隆细胞株细胞用10mg/L CMDiI（氯甲基苯甲酰氨二[十八烷基]四甲基吲哚羰基花青高氯酸盐）工作液（CMDiI荧光染料20μg，用PBS液充分溶解并定容至2mL）孵育染色，收集细胞用PBS漂洗2次，用CASY细胞快速分析仪进行细胞计数，用200mL/L胎牛血清DMEM/F12（1∶1）（pH 7.2）培养液至调整细胞密度为4.2×109备用。取1mL CMDiI标记的HCE种子细胞接种于预铺有mdAM的24孔培养板孔中，置50mL/L CO2培养箱中、37℃培养，每2d换液1次，待长成单层后用于新西兰兔穿透性角膜移植。
1.2方法 取健康新西兰兔12只，右眼作为实验组，进行TEHCE的穿透性角膜移植。移植新西兰兔用氯丙嗪联合氯胺酮麻醉后，右眼消毒铺巾，直肌牵引缝线，用环钻标记直径为7mm的角膜中央区域，于1∶00位用板层刀切入角膜，于标记线切开180°～270°之间，翻开角膜撕除后板层；钻取直径7.5mm大小的TEHCE，将内皮面向下植入代替撕除的后板层（角膜内皮层和DM），剪除多余的边沿部分后，复位基质瓣，100尼龙线间断缝合，生理盐水注入置换黏弹剂并形成前房水密，术毕用妥布霉素/地塞米松眼液滴眼，正常饲养，每天在手术眼表涂抹阿托品和典必殊，并观察手术眼的外观以及是否出现水肿和排斥等不良反应。12只兔的左眼作为对照组：4只兔不进行移植手术，作为空白对照；4只兔进行单纯mdAM移植，作为羊膜对照；4只兔进行单纯后板层撕除，不移植TEHCE或mdAM，作为损伤对照。移植术后每日用裂隙灯观察新西兰兔眼并照相，记录实验组和对照组角膜透明度及角膜厚度变化。移植手术后39d后处死新西兰兔，分别剪取实验右眼和对照左眼的角膜，用眼科剪将角膜沿中线平均剪成4片：一片置Nikon TE2000U倒置荧光显微镜下观察角膜内皮层CMDiI荧光标记后，再经10g/L茜素红染色后置Nikon E 200显微镜下观察照相，检测细胞间连接的形成情况以及细胞单层的完整性；一片用冰冻胶低温固定后进行冰冻切片（厚5～6 μm），固定、空气干燥和苏木素伊红（HE）染色后，置Nikon E 200光学显微镜下观察照相，检测细胞单层的完整性以及细胞与羊膜结合的程度；一片用40g/L戊二醛蔗糖添加二甲胂缓冲液固定，进行CO2临界点干燥和喷金处理，用JSM 2840扫描电镜进行观察，检查细胞形态以及细胞单层的形成情况；一片用40g/L戊二醛蔗糖添加二甲胂缓冲液固定后，按常规方法处理和进行超薄切片，利用H700透射电镜进行观察，检查种子细胞的超微结构，以及细胞之间、细胞与载体支架之间的连接情况。
2结果
2.1移植兔眼的透明状态 裂隙灯照相结果显示，TEHCE移植后的新西兰兔，其角膜没有出现水肿和排斥等反应，新西兰兔移植右眼自移植2d后持续保持透明状态，持续透明时间已长达39d以上（图1）。而进行单纯mdAM移植的新西兰兔，以及进行单纯后板层撕除不作任何移植的新西兰兔，其角膜均不透明（结果未给出）。表明所植入的TEHCE可使兔角膜长期保持透明。
2.2移植兔眼角膜内皮层的变化 移植39d后新西兰兔右眼角膜内皮移植区出现了红色CMDiI荧光（图2A），而周边的非移植区细胞则没有此荧光标记。表明角膜内皮移植区的细胞均为来自TEHCE的种子细胞。移植39d后新西兰兔角膜在厚度和组织结构上与未移植对照眼角膜相似（图2B）。此外，所植入的TEHCE种子细胞在角膜内皮面形成了完整的细胞单层，且种子细胞与DM之间结合紧密。所植入的TEHCE仍为完整的连续细胞单层，其种子细胞之间形成了广泛的细胞连接，细胞形态大多为六角形（图2C）。表明所植入TEHCE重建出了类似在体角膜内皮（细胞）的单层角膜内皮（细胞）。TEHCE种子细胞在植入39d后绝大多数呈为六角形细胞形态，细胞之间镶嵌紧密，形成了完整的角膜内皮层（图2D）。植入39d后的TEHCE，其种子细胞在角膜内皮面形成了连续的细胞单层，且细胞及其分泌产生的DM与角膜基质连接紧密，形成了一个有机整体（图3A），与对照兔眼角膜的形态结构相似（图3B）；TEHCE种子细胞的超微结构（图3C）与对照眼兔角膜内皮细胞（图3D）相似，均含有大量的粗面内质网和线粒体。表明移植后TEHCE种子细胞的结构正常，不仅重建出了角膜内皮层，HCE还分泌产生了DM。
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