【摘要】 目的：探讨高眼压视神经损伤中NO的作用。方法：SD大鼠20只，随机分为空白对照组4只，另16只大鼠右眼为实验组，施行高压前房灌注维持时间60min，按照高眼压后再灌注时间不同又随机分为4小组，每组4只，即高眼压后0.5，1，3和7d组。各组应用NADPH黄递酶法检测外侧膝状体一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）的表达及分布情况。结果：空白对照组及实验各组外侧膝状体均有NOS表达，NOS阳性细胞在外侧膝状体主要分布于腹外侧核。各实验组外侧膝状体的NOS阳性细胞数明显高于空白对照组（P＜0.01）；实验各组中高眼压后1d组的NOS阳性细胞数明显高于其它3组实验组（P＜0.01）；其它3组实验组之间比较无显著性差异。结论：NO既参与眼正常生理功能的调节，也在高眼压视神经及其上行视觉通路的损伤中发挥重要作用。
【关键词】 一氧化氮合酶；高眼压；NADPH黄递酶法
Expression of nitric oxide synthase in the lateral geniculate nucleus of rats with acute ocular hypertension
Hui Hang, ChengHua Zhu, Hu Liu, YanPing Ma
Department of Ophthalmology, the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing 210029, Jiangsu Province, China
Abstract
AIM: To investigate the expression of nitric oxide synthase(NOS) in the retinas and lateral geniculate nucleus(LGN) of rats with acute ocular hypertension.
METHODS: Four of 20 SD rats were randomly selected as blank control. The right eyes of the other 16 rats as control were perfused with sterile saline into the anterior chamber to elevate the intraocular pressure, and the maintaining time was 60 minutes. Rats were sacrificed at 0.5, 1, 3 and 7 days after perfusion, and NOS expression in LGN were detected by NADPHdiaphorase histochemistry.
RESULTS: The staining of NOS were localized in LGN of all the blank control and experimental group. In the LGN, NOS was mainly in the ventral part of LGN(vLGN). The count of NOS staining cells in the experimental group was significantly more than the blank control（P＜0.01）. In the experimental group, NOS was significantly higher at 1 day after perfusion compared with other three experimental groups（P＜0.01）. Numbers of NOS positive cells in other time points after perfusion had no statistical significance.
CONCLUSION: NO not only plays an important role in normal function of eye, but also induces injury to the LGN of rats with acute ocular hypertension.
KEYWORDS: nitric oxide synthase; high intraocular pressure；NADPHdiaphorase
0引言
青光眼已被世界卫生组织列为继白内障之后的第2位致盲眼病。青光眼经典的视神经损伤理论是高眼压机械压力学说和血管缺血学说共同参与的结果。然而临床上常见手术或药物眼压控制良好的青光眼患者或者正常眼压性青光眼患者，他们的视神经损害和视野缺损仍在进一步加重。所以青光眼的视神经损伤机制尚有其它多种复杂因素参与。许多研究已经发现，一氧化氮（nitric oxide，NO）在青光眼模型的视网膜和视神经的含量增加[1]。进一步研究，在兔眼玻璃体腔内注射NO供体（S亚硝基N乙酰DL青霉素，SNAP）可引起视神经明显的变性，包括大量RGC（retinal ganglion cell）死亡[2]，而应用一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）抑制剂可保护青光眼患者RGC不丢失，同时也降低体外培养的RGC对NO毒性的敏感性。从正反两面佐证了NO在青光眼视神经损伤中的作用。我们研究NO在青光眼模型的外侧膝状体表达和分布情况，试图寻找视神经损伤时是否同时存在上行通路的损伤，以及它们之间存在什么样的联系。
1材料和方法
1.1材料 选取2～3月龄，体质量200～300g，雌雄不限SD大鼠20只由南京医科大学实验动物中心提供。随机选4只作为空白对照组；16只为实验组，右眼分别施行高压前房灌注维持时间60min，按照高眼压后再灌注时间不同又随机分为4小组，每组4只，即高眼压后0.5，1，3和7d组；NADPHd（还原型尼克酰胺嘌呤二核苷酸磷酸黄递酶，Roche公司），NBT（硝基四氮唑蓝，Roche公司），Leica共聚焦显微镜，Leica Qwin QG2232 V2.3 图像分析处理系统。
图1 大鼠外侧膝状体NADPH黄递酶染色（×50） A：高眼压3d；B：空白对照组；C：高眼压0.5d；D：高眼压1d；E：高眼压3d；F：高眼压7d。（略）
1.2方法 SD大鼠用30g/L戊巴比妥30mg/kg ip麻醉后，固定大鼠头部，采用生理盐水前房持续灌注法制备大鼠急性高眼压模型。先予2.5g/L托吡卡胺眼液两次双眼散瞳，然后用4号针头于右眼颞侧角膜缘做一前房穿刺口，将连接生理盐水输液袋的Healon针头从穿刺口置入前房，固定好针头，升高输液袋的高度至距大鼠眼的垂直距离136cm，此高度差可在大鼠眼内形成100mmHg的眼内压，维持灌注时间60min，制成大鼠急性高眼压模型。术后给予氯霉素眼液、红霉素眼膏预防感染。造模术后0.5，1，3，7d（每个时间点4只大鼠）分别用30g/L戊巴比妥30mg/kg ip麻醉后，经左心室插管至主动脉快速灌注生理盐水100mL，再用40g/L多聚甲醛500mL维持灌注2～3h。术毕取脑组织，于40g/L多聚甲醛中后固定2～3h后，置于300g/L蔗糖溶液中4℃过夜。待组织标本沉底后取出，制作冰冻切片标本：做经外侧膝状体平面的冠状切片（引自《The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates》Compact Third Edition），厚30μm。置于0.01mol/L PBS，pH7.4中待用。冰冻切片标本用0.01mol/L PBS，pH7.4重复漂洗3次，每次3min。然后置于孵育液中，在37℃温箱孵育60～90min。孵育液由0.6g/L NADPHd（还原型尼克酰胺嘌呤二核苷酸磷酸黄递酶，Roche公司），0.6g/L NBT（硝基四氮唑蓝，Roche公司），300g/L tritonX 100，和0.1mol/L PBS，pH8.0组成。染色完成后加入0.01mol/L PBS，pH7.4冲洗3次，每次3min，终止反应。常规脱水，中性树脂封片。用Leica Qwin QG2232 V2.3 图像分析处理系统，每组选取3张来自不同大鼠的切片，每张切片取3个不同高倍镜视野（×200）。
统计学分析：利用SPSS 10.0统计软件进行统计学分析，计数外侧膝状体NOS染色阳性的细胞数，采用单因素方差分析。
图2 外侧膝状体NOS阳性细胞数。（略）
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