作者：马义宾，刘艳娣 作者单位：（1.泰山医学院附属泰安医院眼科医院,山东 泰安 271000; 2.莱阳农学院校医院,山东 莱阳 265200）
【摘要】 目的 研究20%乙醇不同浸润时间，对兔角膜上皮细胞活性的影响,为LASEK术中选择适宜的乙醇浸润时间提供理论依据。方法 10只实验兔按每组2只随机分为5组：正常对照组、20S组、30S组、40S组、50S组，实验组分别行20%乙醇浸润20 s、30 s、40 s、50 s。角膜标本分别行酶组织化学染色观察。结果 与正常对照组相比，20%乙醇浸润兔角膜上皮细胞20 s、30 s，细胞活性无明显降低（P>0.05）；浸润时间一旦达到或超过40 s，细胞活性明显降低（P<0.001）。结论 LASEK术中20%乙醇的最适浸润时间以不超过30 s为宜。
【关键词】 准分子激光上皮瓣下角膜磨镶术；乙醇；代谢；活性
Experimental Study on the Vitality of Corneal Epithelieum after Exposed
to 20% Alcohol for Different TimeMA Yi-bin，LIU Yan-di
(1. Eye Hospital of Taian Central Hospital,Taian 271000,China; 2. Laiyang Agricultural College;Taian 265200,China)
Abstract：Objective To evaluate the vitality of corneal epithelieum after exposed to 20% alcoholic solution for different time. Methods: According to the time of rabbits sacrifice,10 healthy adult New Zealand white rabbits were devided into 5 groups randomly.They were fresh control group, 20S group,30S group,40S group and 50S group . In experimental groups the eyes were exposed to 20% alcoholic solution for 20s,30s,40s or 50s. Enzyme histochemistry methods with VIDAS image analysis system were used to evaluate the metabolic enzyme activities,lactate dehydrogenase (LDH) and succinate dehydrogenase (SDH). Results:Contrast with the fresh control group ,the corneal epithelial cells which were infiltrated by 20% alcohol for 20s or 30s,remained satisfactory vitality,（P＞0.05）;While those were infiltrated for 40sor 50s, had been weakened deeply，（P＜0.001）.Conclusion: The density of alcoholic solution and the time to be exposed for were very important to laser epithelial keratomileusis(LASEK).20% alcoholic solution last not more than 30 seconds will be more successful.
Key words：laser epithelial keratomileusis; metabolism; alcohol; vitality
准分子激光上皮瓣下角膜磨镶术（laser epithelial keratomileusis,LASEK）治疗屈光不正在临床上已经取得了良好的效果。有关LASEK的临床报道中乙醇的浓度多统一于20%左右，而乙醇的具体浸润时间却为20 s、30 s、40 s、50 s不等。本研究采用20%的乙醇作为最适乙醇浓度，浸润时间选择为20 s、30 s、40 s、50 s，通过研究兔角膜上皮细胞活性的变化，寻求最佳作用时间，为LASEK术中选择乙醇的最适宜浸润时间提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 材料
健康的成年新西兰大耳白兔10只（20眼），体重2000 g～2500 g，无眼部疾患，雌雄均用。按照乙醇浸润时间随机分为20S组、30S组、40S组、50S组和正常对照组，每组2只（4眼）。实验组分别行20%乙醇浸润角膜上皮细胞20 s、30 s、40 s、50 s。实验动物购自泰安市药检所动物实验中心，由本院动物实验室饲养。
1.2 方法
1.2.1手术方法 术前用0.3%的氧氟沙星滴眼液点兔眼，每小时1次，共计6次。3%的戊巴比妥溶液1 ml/kg自兔耳缘静脉注入，全麻后乙醇消毒铺巾，BSS冲洗结膜囊。0.4%倍诺喜表面麻醉2次。以瞳孔为中心将内径9 mm的角膜上皮环钻固定于角膜上，将新鲜配制的20%的乙醇溶液（1 ml纯度为99.7%的无水乙醇中加入4.0 ml注射用蒸馏水）0.15 ml置于上皮环钻内，计时20 s、30 s、40 s、50 s不等，吸血海棉吸干乙醇，BSS充分冲洗。空气栓塞法处死实验兔，BSS冲洗结膜囊，8.5 mm直径角膜环钻以瞳孔为中心全层钻通角膜制取角膜标本备用。
1.2.2 乳酸脱氢酶（LDH）、琥珀酸脱氢酶（SDH）的酶组织化学染色测定 离体角膜标本要低温保存，30 min之内行OCT（冷冻包埋剂）包埋。6 h内在CRYOCUT1800型恒低温切片机中制成10 mm的冰冻切片，继之完成染色。每份角膜标本切片6张，每种酶3张（其中一张为阴性对照）。染色后当天完成光密度测定，尽可能减少酶活性的降低。
1.2.3 LDH的酶组织化学染色过程（底物为乳酸钠） 新鲜冰冻切片于37 ℃孵育液中孵育30～60 min, 丙酮去粉红色甲臜, 蒸馏水洗5 min, 15%福尔马林盐水15 min, 蒸馏水洗5 min, mayer复染, 流水冲洗5 min, 蒸馏水洗3 min, 脱水, 二甲苯透明, 中性树脂封片。
1.2.4 SDH的酶组织化学染色过程（底物为琥珀酸钠）：新鲜冰冻切片于37 ℃孵育液中孵育20 min, 蒸馏水洗净（必要时2%甲绿复染核）, 甘油明胶封片。
1.2.5 对照方法为去底物法，来源于Lojda［1］。
1.2.6 酶组织化学染色完成2 h内，应用图象分析系统（VIDAS-21软件）随机测量角膜上皮层的光密度值（OD），取其平均值，进行统计学分析。
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