作者：张强 赵 燕 李 燕 王 强 作者单位：滨州医学院眼科学教研室 滨州市 256603
【摘要】 目的 探讨体外培养小梁细胞表面整合素表达及其意义。方法 对牛眼小梁细胞进行原代及传代培养，并行鉴定。对传三代的牛眼小梁细胞施加整合素β1一抗，后分别给予荧光和多聚辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗，并将细胞置于荧光倒置显微镜下观察摄像。结果 应用免疫荧光和免疫酶技术方法均可观察到培养小梁细胞表面整合素β1阳性染色。结论 体外培养的牛眼小梁细胞表达整合素β1，为以后研究原发性开角型青光眼病因学提供良好实验基础。
【关键词】 牛眼小梁细胞；整合素；细胞外基质；青光眼
Expression of integrinβ1 in cultured bovine trabecular meshwork cells
ZHANG Qiang ZHAO Yan LI Yan et al
Dapartment of Ophthalmology,Binzhou Medical University,Binzhou 256603
【Abstract】 Objective To study the expression and significance of integrinβ1 in cultured bovine trabecular meshwork(BTM) cells Methods BTM cells were primarily cultured and subcultured, and rendered identification. The third generation BTM cells were rendered rabbit AntiIntegrin β1, stained with antiintegrinβ1 by FITCIgG and HRPIgG.The BTM cells was observed by inverted microscope, and taked pictures.Results Making use of immunofluorescence and immunohistochemistry, we observed positive staining of integrinβ1 in cultured BIM cells.Conclusion Cultured bovine trabecular meshwork cells express integrinβ1，and can be used as good experimental base for researching etiology of POAG in the future.
【Key words】 trabecular meshwork,integrin,extracellular matrix;glaucoma
整合素（integrin）是一类细胞膜表面的糖蛋白受体家族分子, 在人体各种组织中表达, 它介导细胞与细胞、细胞与细胞外基质(extracellular matrix,ECM)之间的反应, 参与细胞信号传递、细胞黏附、迁移, 控制细胞分化、增殖以及凋亡等各种生理过程。人眼房水外流阻力主要存在于小梁网组织, 小梁网内环境的稳定是保持房水外流通畅、维持正常眼内压的关键因素。随着分子生物学等相关学科的发展, 人们观察到小梁网表达多种整合素亚单位, 并对其之间的关系进行了深入研究。目前牛小梁细胞体外培养技术已趋成熟，能为试验研究提供丰富的细胞，是研究人小梁细胞生物学功能的良好替代方法。我们研究体外培养牛小梁细胞表面整合素表达，探讨其在青光眼发病机制中的意义。
1 材料与方法
1.1 牛眼小梁细胞培养及细胞鉴定 采用杨新光等培养方法及本实验室既往方法［1］, 新鲜牛眼常规消毒后, 截取角巩膜缘后5 mm距离，去除虹膜及晶状体等眼前节部分, 在体视显微镜下辨别Schawlbe线以及巩膜突, 以显微镊轻轻撕取乳白色疏松网状小梁组织, 移入培养瓶于37℃培养箱静置0.5～1 h，待组织块贴壁后加入高糖DMEM培养液［含15%胎牛血清,10 mmol/L Hepes（购自Sigma公司）,青霉素、链霉素各100 U/ L，2.5 μg/ml两性霉素B，2 mmol/L谷氨酰胺,于恒温培养箱(37℃, 5%CO2，饱和湿度)培养, 每5 d更换培养液, 倒置荧光显微镜观察细胞生长特性、形态特征, 从形态学角度鉴定细胞。0.25%胰酶和0.02%EDTA混合液消化传代。取第四代细胞接种于预置消毒盖玻片（多聚赖氨酸包被）的24孔培养板(Costar公司产品)中。
细胞生长近融合期时, 0.01 mol/LPBS(pH 7.2)缓冲液冲洗, 4%多聚甲醛溶液固定, 室温干燥备用。免疫荧光法行神经元特异性烯醇化酶(NSE)及Ⅷ因子相关抗原染色（一抗兔抗NSE，二抗羊抗兔FITCIgG 均购自博士德公司）, 激光共聚焦显微镜下观察以鉴定小梁细胞组织来源。
1.2 实验方法 免疫荧光法：取已固定细胞玻片, PBS振洗5 min×3次, 滴加羊血清工作液37℃20 min，后甩干，加兔多克隆抗体antiintegrinβ1 (武汉博士德产品, 工作浓度1：200, 0.1 mol/LPBS稀释，4℃过夜, 次日晨, 室温PBS 振洗5 min×3 次,均匀滴加羊抗兔FITCIgG (博士德公司，工作浓度1∶90, BSA配置的PBS稀释至1%),37℃恒温箱30 min,PBS振洗5 min×3次, 500 g·L-1缓冲甘油封片, 行倒置荧光显微镜(400×)观测并摄片。
免疫酶方法：取已固定细胞玻片, PBS振洗5 min×3次, 3％的H2O2甲醇溶液（1 ml 30% H2O2，9 ml甲醇）灭活内源性过氧化物酶室温20 min，滴加羊血清工作液封闭非特异性抗原37℃20 min，后甩干，加兔多克隆抗体antiintegrinβ1，4℃过夜, 次日晨, 室温PBS 振洗5 min×3 次, 均匀滴加多聚辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗兔IgG(即用型，北京中衫公司)37℃ 30 min。PBS振洗3次,每次3min，滴加ABC复合剂显色,镜下控制时间。逐级脱水（75%酒精5 min，95%酒精5 min×2，分析纯5 min×2）透明（二甲苯2 min×2），中性树胶封片，镜下（×400）观察。阴性对照以PBS代替一抗。
2 结果
2.1 倒置显微镜下观察见细胞生长良好, 呈多角、树枝状、不规则三角形, 多细胞突起（图1）。取传三代细胞进行鉴定（图2），共聚焦显微镜下观察NSE染色阳性, 荧光呈规则散在分布于细胞基质（图3）, 第Ⅷ因子相关抗原阴性。其结果与贺翔鸽相同［2］,证明为神经外胚层神经嵴间充质来源,可以确认所培养细胞为小梁细胞。
2.2 体外培养牛眼小梁细胞整合素β1免疫荧光和免疫酶染色均呈阳性，荧光信号和棕黄色颗粒阳性信号位于胞膜和胞浆内，阴性对照未见阳性信号（图4～6）。
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