作者：吴彤 张红 刘丽娟 作者单位：吉林大学第一医院干部病房，吉林 长春 130021
【摘要】 目的 检测倍他洛尔(Betaxolol)在缺氧缺血条件下对视网膜神经节细胞(RGCs)钙通道的作用。方法 体外培养RGCs，并用免疫组织化学染色鉴定，采用膜片钳技术观察倍他洛尔在缺氧条件下对大鼠RGCs 钙通道的变化。结果 缺氧导致RGCs钙通道电流增加，可被NMDA受体阻断剂抑制，具有显著性差异(P＜005)。加入1～100 μmol/L倍他洛尔能抑制兴奋性氨基酸引起的视网膜神经节细胞电压门控钙电流，具有明显统计学意义(P＜001)，其抑制作用呈剂量依赖性。结论 倍他洛尔可能通过阻断RGCs的谷氨酸受体调控钙通道电流，调整RGCs的生物学功能，对视网膜和视神经疾病起神经保护作用。
【关键词】 倍他洛尔；钙流；谷氨酸；缺氧；视网膜神经节细胞
倍他洛尔(Betaxolol)，是选择性β1肾上腺受体拮抗剂，是一种抗青光眼药物。在眼部青光眼治疗中通过阻断睫状上皮β肾上腺受体减少房水生成，降低眼压。Betaxolol似乎对血管有直接松弛作用，对眼血流有益〔1〕。应用相对缺乏β肾上腺受体的猪睫长后短动脉和牛视网膜动脉进行体外研究，发现Betaxolol的血管松弛作用涉及阻断钙通道〔2〕。这个结果与原来研究证实的Betaxolol对豚鼠动脉和静脉电压依赖钙通道的抑制作用是一致的〔3〕。应用谷氨酸兴奋毒性的体外细胞培养模型显示，除了降眼压作用，Betaxolol可以作为视网膜神经保护剂。Betaxolol的神经保护作用是对缺血缺氧性损伤导致谷氨酸能受体过度激活引起的钙流入，随后激活下游介质，自由基形成和细胞凋亡的减少〔4〕。本文旨在研究Betaxolol对视网膜神经节细胞(RGCs)离子流的作用，尤其是钙通道电流，来证实Betaxolol直接作用于RGCs神经元来抑制钙通道和谷氨酸受体电流，最终减少钙内流，这一药物在神经元损伤模型中具有神经保护作用，为临床防治青光眼及其他视网膜疾病的治疗提供一定的理论依据。
1 材料与方法
11 RGCs的培养
111 实验前准备 鼠尾胶原的制备和培养板的处理同钟一声等〔5〕报道的方法，96孔板每孔加鼠尾胶原20 μl。24孔细胞培养板在包被鼠尾胶原前，板内放置1 cm×1 cm的玻片，然后滴加鼠尾胶原包被玻片，每孔加鼠尾胶原40～80 μl。
112 RGCs悬液的制备 取生后2～3 d SD大鼠，浸于75％酒精中处死并消毒，轻轻摘除眼球，置于含100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的DHank液内漂洗3次。在显微镜下，沿角巩缘剪除角膜，用镊子去除晶体及玻璃体，然后钝性分离出神经层视网膜组织。用DHank液将视网膜漂洗3次，置于008％胰蛋白酶(美国Sigma公司产品)于37℃消化30 min，加入10％小牛血清的DMEM培养液终止消化。将上液以300 r/min离心，共3～5 min，弃去上清液，加入培养液(80％DMEM、20％胎牛血清、6 mg/ml葡萄糖、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素、2 μg/ml二性霉素、25 mmol/L氯化钾及10 mmol/L Hepes液)8 ml，用钝头吸管吹打使之成为细胞悬液，行细胞计数，调整培养液量使每ml含1×106个细胞。
113 接种培养 上述细胞悬液接种于预先经鼠尾胶原包被的24孔培养板内，每孔约06 ml RGCs悬液，置于体积分数为5％的CO2培养箱内，于37℃下培养。24 h更换含5溴2′脱氧尿苷(20 μg/ml，美国Sigma公司产品)以抑制非神经细胞生长，48 h更换培养液，每天在倒置显微镜下观察细胞生长过程及形态变化。
114 RGCs的鉴定 取培养第5天的细胞行大鼠THY1单克隆抗体(美国Sigma公司产品)免疫细胞学检查。盖玻片用001 mol/L的PBS冲洗3次，加入抗大鼠THY1单克隆抗体(1∶20，PBS稀释)；置于4℃冰箱过夜，PBS清洗3次后，加入HRP标记的羊抗鼠IgG(1∶100，PBS稀释)，置室温下1 h，PBS清洗3次，加入不含过氧化氢的邻苯二胺，置于暗处反应30 min后，DAB显色，PBS清洗终止反应。光镜下观察，随机计数每10个高倍镜下(200倍)胞膜完整、无空泡形成以及突起、生长良好的阳性染色细胞。我们实验所用于膜片钳的细胞在显微镜下根据其典型形态进行确认，保证了实验所用细胞的可靠性。
12 记录钙电流所用的溶液〔6〕 细胞外液(mmol/L)：70 NaCl；25 KCl；10 BaCl2；5 CsCl；15 EGTACl；10 葡萄糖液 ；10 HEPES；TTX 0001(pH=73 with NaOH)。电极液(mmol/L)：95 CsCl；3 MgCl2；1 EGTA；10 HEPES(pH=73 with CsOH)。实验中选择长度为20～40 μm的细胞为实验细胞。模拟缺血缺氧溶液，在正常细胞外液中加入乳酸钠20，95％N2＋5％CO2饱和(pH=68 with NaOH)。
13 全细胞通道钙通道电流的记录方法和实验所用的溶液 用两次拉制法将毛坯(上海脑研所生产)拉成微电极，其尖端直径范围为08～ 1 μm。抛光、冲灌电极液后，电阻范围为1～3 MΩ。将微电极经微电极夹持器的侧管与注射器相连。边用注射器向微电极加正压，边将微电极缓缓插入浴液，直至接触培养的神经节细胞，去掉正压，转而用注射器抽吸，形成10～20 cmH2O的负压。当电极尖端与细胞膜表面形成1～5 GΩ封接电阻时，用力吸破电极尖端上的膜片，形成全细胞记录。
14 数据的采集及分析 由计算机软件(Pclamp602，Axon，美国)，经数/模(D/A)卡(DigiData 1200，Axon)转换成电压信号，控制细胞的膜电位。将记录到的细胞膜电流信号通过 探头，输入膜片钳放大器(CEZ2400B，日本)，经膜片钳放大器的电流电压转换，输入到模/数(A/D)转换卡，并存入硬盘以便进一步分析处理，其采样频率为1 kHz，低通滤波器滤波频率为1 kHz。
15 数据的统计学处理 计量数据用x±s表示，各组之间的数值比较采用样本均数ｔ检验进行统计学分析。
2 结果
21 RGCs钙通道电流的特性 保持电压控制在-70 mV，阶跃命令为+10 mV，去极化至+0 mV，持续时间为200～300 ms。可记录到一个电压依赖性的内向钙(ICa)电流，峰值电流为25617±1130 pA(n=6)。当在浴液中加入钙通道阻断剂尼索地平(nisoldipine 10 μmol/L)，其通道电流显著降低(1465±1401 pA)(n=6)。表明为电压依赖性L型钙电流〔8〕。
22 缺氧RGCs钙通道电流(ICa)的特性 将培养的RGCs灌流模拟缺血缺氧溶液，并放置在倒置显微镜的密闭仓内，同时给予95% N2和5% O2，造成缺氧模型，缺氧20 min后开始实验记录，将保持电压控制在-70 mV，阶跃命令为+10 mV，去极化至60 mV，持续时间为200～300 ms。观察了L型钙通道电流(ICa)的特性。在缺血缺氧条件下，钙通道的峰值电流大约在+10 mV(IPeak(Ca))为28717±1469 pA(n=6)。与正常对照组相比(25617±1130 pA)，其幅值增加了12%(P＜001)。向浴液灌流谷氨酸受体阻断剂APV(2amino5phosphonovalerate)，钙通道的峰值电流为26383±1174 pA(n=6)，与正常对照组相比无统计学意义(P＞005)。表明缺氧缺血可引起RGCs的钙通道电流增加，而APV可抑制缺氧缺血可引起RGCs的钙通道电流增加的效应，见图1。
A B
A：从-70 mV保持电位阶跃至+10 mV的峰值钙电流；
B：电流电压(I/V)关系曲线
图1 缺氧视网膜神经节细胞原始钙通道电流曲线（略）
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