作者：肖瑛 作者单位：山东 济南 250012 齐鲁医院眼科
【摘要】 目的：通过检测相同胎龄父母近视程度不同的胎儿后极部巩膜碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)和转化生长因子β(transforming growth factorbeta，TGFβ)的表达水平，探讨bFGF和TGFβ在人类近视遗传和近视形成过程中是否发挥作用。方法：对16例14周以下引产的胎儿，按父母无近视和父母近视＞-4.00D分为对照组和实验组，每组8例，免疫组化和RTPCR方法检测后极部巩膜bFGF和TGFβ的表达，确定两组是否存在差异。结果：两组bFGF和TGFβ在巩膜中均有表达，实验组BFGF的表达较对照组高，两者比较差异有统计学意义(P＜0.05)，实验组TGFβ的表达较对照组低，两组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。结论：近视家族胎儿在巩膜发育阶段就有bFGF和TGFβ的某些改变，bFGF和TGFβ在人类近视的形成和遗传中可能发挥一定作用，是近视多基因遗传因素中的相关因素之一。
【关键词】 胎儿 巩膜 近视 碱性成纤维细胞生长因子 转化生长因子β
XIAO Ying1， LI Jinghai2， ZHOU Yabin3， GAO Zhijuan1， TANG Wei3
（1. Department of Ophthalmology， Second Hospital of Shandong University, Jinan 250033, Shandong, China;
2. Department of Ophthalmology， Qilu Hospital of Shandong University, Jinan 250012, Shandong, China;
3. Institute of Pathogenic Biology, Jinan 250012, Shandong, China）
［ABSTRACT］ Objective: To evaluate the expression of basic fibroblast growth factor(bFGF) and transforming growth factorbeta(TGFβ) of the posterior sclera in human fetuses of the same month. Methods: Sixteen eyes of human 14week fetus were divided into two groups: the experimental group whose parents were myopia with a refraction over -4.00?D and the control group whose parents were without myopia. The expressions of bFGF and TGFβ in the posterior sclera were determined and quantitatively analyzed by immunohistochemistry and RTPCR. Results: The expression of bFGF in the experimental group was significantly higher than that in the control group (P＜0.05), while on the contrary, the expression of TGFβin the experimental group was significantly lower than that in the control group (P＜0.05). Conclusion： The expressions of bFGF and TGFβ in the posterior sclera of the fetal eyes of the same fetal month are significantly different between myopia families and nonmyopia families.
［KEY WORDS］ Human fetus； Sclera； Myopia； bFGF； TGFβ
近年的动物研究发现，实验性近视发生发展过程中视网膜及巩膜的碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)和转化生长因子β(transforming growth factorbeta，TGFβ)含量发生改变，而外源性的bFGF和TGFβ也可以影响近视的形成，但其作用机制仍不明确，研究结果也不完全一致。本研究采用免疫组化和RTPCR方法对胎儿眼球巩膜bFGF和TGFβ的表达进行了观察，旨在探讨其在近视发生发展及遗传中的作用机制。
1 资料与方法
1.1 标本的采集 收集山东大学第二医院妇产科各种方法引产的胎龄14周以下的胎儿16例，按父母近视程度分为2组，父母无近视为对照组,父母近视＞-4.00?D为实验组，每组8例。引产后胎儿立即摘除眼球，去除眼外肌、眼球筋膜，沿角膜缘剪开眼球，去除眼内容物、视网膜、脉络膜等组织，留取后极部4 5?mm范围巩膜组织，去掉视神经后，立即置入去RNA酶的Ep管中,-80?℃冰箱保存。
1.2 免疫组化染色（SABC法）检测巩膜bFGF和TGFβ的表达
1.2.1 试剂 一抗：兔抗TGFβ、兔抗bFGF，SABC免疫组化染色试剂盒。二抗：山羊抗兔IgG，SABC:链酶亲和素-生物素-过氧化物酶复合物，DAB显色试剂盒，均购于武汉博士德生物工程有限公司。
1.2.2 操作步骤 组织固定于10%甲醛24?h，石蜡包埋，制备5?μm石蜡切片。二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化；热抗原修复；加一抗；滴加生物素化山羊抗兔IgG, 滴加试剂SABC。DAB染色，中性树胶封片，用PBS代替一抗，作为阴性对照。
1.2.3 结果判定 光镜下（×200）观察，随机选取阳性细胞均匀的10个视野，计数细胞总数及阳性细胞数所占比例。胞浆中的棕黄色颗粒为阳性效应的标志，强阳性（+〖KG-*3]+〖KG-*3]+），阳性细胞数＞50%，中度（+〖KG-*3]+），阳性细胞数25% 30%,弱阳性（+），阳性细胞数10% 24%,阴性（-），阳性细胞数＜10%。
1.3 逆转录-聚合酶链反应(RTPCR)检测巩膜bFGF和TGFβ的表达
1.3.1 试剂 UNIQ10柱Trizol总RNA抽提试剂盒，MMLV第一链cDNA合成试剂盒，即用PCR扩增试剂盒，购于上海生工生物工程技术有限公司。
1.3.2 引物 通过Genebank网站查找基因全序列，根据基因引物设计原则，应用软件Primer premier 5.0设计。引物序列：TGFβ的上游引物5′ACCCACAACGAAATCTATGACA3′，〖CM(4*2]下游引物5′AAGGCGA
AAGCCCTCAAT3′，扩增长度312?bp；bFGF的上游引物5′TGGTATGTGGCACTGAAACG3′，下游引物5′CTCAATGACCTGGCGAAGAC3′，扩增长度734?bp；βaction：上游引物5′ACCCAAACTATGGCTTCC3′，下游引物5′AAATACTCCTGCTTGCTGA3′，扩增长度446?bp。由上海博亚生物技术有限公司合成。
1.3.3 步骤 采用Trizol一步法提取组织总RNA，紫外分光光度计上测RNA的纯度，A260：A280应在1.8 2.0之间的进入下一步实验，取1?μg RNA逆转录生成cDNA,采用50?μl反应体系进行PCR扩增，反应条件：94?℃预变性4?min，95?℃变性45?s，55?℃退火60?s，72?℃延伸45?s，共35个循环，末次循环后72?℃延伸5?min。产物以2%琼脂糖凝胶电泳,将凝胶放入扫描仪，电泳图像输入Kodak凝胶分析系统,对各条带进行密度扫描定量，以靶基因与βactin的比值表示TGFβ和bFGF mRNA的相对表达水平。
1.4 统计学处理 所有均数用±s表示，输入SPSS11.0统计软件，两组比较采用t检验,P＜0.05为差异具有统计学意义。
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