作者：佘洁婷， 张少冲， 程建新， 冷云霞
【目的】 探讨急性甲醇中毒大鼠模型的制作方法及其眼部改变，为研究中毒后视功能损害及救治方法建立基础。【方法】 SD大鼠32只，随机分为A（低剂量甲醇组）、B（高剂量甲醇组）、C（生理盐水对照组）、D（空气对照组）四组，每组8只。A、B组吸入N2O/O2混合气及不同剂量甲醇灌胃，C组吸入N2O/O2混合气及生理盐水灌胃，D组置于正常空气中并按B组剂量给予甲醇灌胃，观察各组大鼠一般情况、体质量及眼部改变、静脉血甲醇浓度、视网膜电图和视网膜组织学改变。【结果】 染毒大鼠反应迟钝、运动失调，视盘充血水肿、视网膜点状出血，A组大鼠体质量为(187±12) g，B组为(176±13) g，较C、D对照组显著减轻（P< 0.05）；A组视网膜电图a、b波振幅分别为(87±13) μV、(187±38) μV，B组a、b波振幅分别为(53±19) μV、(132±39) μV，与对照组相比明显下降（P< 0.05）；视网膜在光镜下表现为各层细胞水肿、排列紊乱及空泡化；电镜下细胞凋亡，线粒体肿胀、嵴断裂；B组动物上述改变尤其明显。【结论】 吸入N2O/O2混合气及甲醇灌胃可建立急性甲醇中毒的大鼠模型，出现典型的视网膜结构和功能改变。
【关键词】 甲醇； 急性中毒； 大鼠模型； 灌胃
Abstract: 【Objective】 To develop a rat model manifesting acute methanol poisoning and study the ocular changes so as to lay foundations for further investigation of visual impairment caused by methanol intoxication and its treatment.【Methods】 Thirty-two SD rats were randomly divided into group A (low methanol dosage group, n=8), B (high methanol dosage group, n=8), C (saline control group, n=8) and D (air control group, n=8). Group A and B were exposed to a mixture of N2O/O2 and given different dosage of methanol by gavage. Group C was exposed to N2O/O2 and given the same volume of saline as group B. Group D was exposed to normal air and given the same dosage of methanol as group B. General condition, body mass, and ocular changes, methanol concentration in venous blood, electroretinogram and retinal histopathologic changes were analyzed.【Results】Methanol-intoxicated rats were characteristic by slow reaction, incoordination, optic disc hyperemia and edema and retinal haemorrhage. Body mass loss was significant in group A and B when compared with group C and D (P< 0.05), which were (187±12) g in A and (176±13) g in B, respectively. A-wave and b-wave of electroretinogram were markedly reduced in group A and B (P< 0.05), which was (87±13) μV and (187±38) μV in group A, and (53±19) μV and (132±39) μV in group B, respectively. Retinal edema, derangement of cells and prominent vacuoles were obvious under light microscope. Morphologic changes under electromicroscope were characteristic by cell apoptosis, mitochondria swollen, and cristae disruption. These changes were more obvious in group B.【Conclusion】Acute methanol poisoning in rats could be successfully duplicated by exposure to a mixture of N2O/O2 as well as methanol administration by gavage, with typical retinal structural and functional changes.
甲醇（methanol, CH3OH）是一种无色、有毒的挥发性液体，可经呼吸道、胃肠道和皮肤吸收进入人体而中毒。近年因饮用假酒致急性甲醇中毒的事件时有发生，随着甲醇在人们生产、生活中应用日益广泛，其意外中毒的可能性不断增加。中毒后幸存者常遗留不同程度的视觉损害，而目前甲醇致视功能损害的机理尚未明确，国内仅见临床病例报道[1]，缺乏相关的实验研究。国外研究采用的大鼠种属在我国并不普及，在建模方法、染毒剂量、评价指标等方面缺乏系统性及可比性[2,3]。本研究采用SD大鼠，设立不同剂量甲醇灌胃组，借鉴人类急性甲醇中毒的诊断标准制订该模型的评价指标，探讨其眼部结构和功能改变，较系统地建立了急性甲醇中毒的大鼠模型，为今后进一步研究视功能损害机理及救治方法打下基础。
1 材料和方法
1.1 主要试剂与仪器
分析纯甲醇（广州化学试剂厂），以生理盐水稀释成质量浓度为30％的甲醇溶液；40 L压缩N2O∶O2混合气体（1∶1，广州气体厂）；4％多聚甲醛、苏木素、伊红（中山眼科中心病理室提供）；2.5％戊二醛、1％四氧化锇（中山大学医学院电镜室提供）；枸橼酸钠抗凝管、生理盐水；NEUROPAKⅡ电生理检查仪（日本光电公司），Stemi 2000-C显微镜（德国ZEISS），H-600透射电镜（日本HITACHI）。
1.2 实验动物分组及模型建立
健康SPF级雄性SD大鼠32只（广东省医学实验动物中心提供，合格证号：粤监证字2005A010），体质量200~220 g，用随机数排序分组法分为4组，每组8只。A组：低剂量甲醇组；B组：高剂量甲醇组；C组：生理盐水对照组；D组：空气对照组。从灌胃前4 h起至实验结束，A、B、C组大鼠均置于一密闭有机玻璃箱中，以2 L/min的速度通入N2O∶O2混合气体，D组大鼠置于正常空气中。开始通气时间定为0 h，分别在第4，24，48 h给各组大鼠灌胃，A组：首次甲醇溶液灌胃剂量为2 g/kg，其后每次1 g/kg；B组：首次灌胃剂量4 g/kg，其后每次2 g/kg；C组：与B组等体积的生理盐水代替甲醇灌胃；D组：按B组剂量给予甲醇溶液灌胃。第60小时停止通气，作各项指标检测。
1.3 模型的评价指标及方法
1.3.1 全身及眼部的中毒表现 观察甲醇灌胃后大鼠的反应、活动、意识状态、体质量变化；裂隙灯观察结膜、角膜、前房、晶状体改变；直接眼底镜观察视网膜血管、视盘等的改变。
1.3.2 视网膜电图检测 于第60天取出大鼠暗适应4 h，复方托品酰胺散瞳，氯胺酮50 mg/kg、氯丙嗪25 mg/kg混合腹腔注射，丁卡因表麻，NeuropackⅡ电生理仪检测视网膜电图（Electroretinogram, ERG），记录I16单次白光刺激下a波、b波潜伏期及振幅。所有操作均在有微弱红光照明的暗室内进行，未检查眼用不透光黑布遮盖避光，角膜电极、参考电极和地电极分别置于角膜表面、舌下和尾部。
1.3.3 静脉血甲醇浓度的检测 ERG检查结束后，剪开大鼠胸腔，从右心房抽取静脉血2 mL注入干燥真空的枸橼酸钠抗凝管中充分振荡，采用顶空气相色谱法检测血中甲醇浓度。
1.3.4 视网膜组织学检查 采血后以断颈法处死大鼠，迅速摘除双眼球，解剖显微镜下去除眼前节，分离视网膜，固定于4％多聚甲醛中48 h，按常规制成石蜡切片，HE染色，光镜下观察。
1.3.5 视网膜超微结构检查 按上述方法分离视网膜，剪出1 mm×5 mm大小视网膜组织，PBS漂洗，固定于2.5％戊二醛4 ℃冰箱过夜，次日1％四氧化锇后固定2 h，丙酮系列脱水，Epon812定向包埋制成超薄切片，醋酸双氧铀γ柠檬酸铅双染色，透射电镜下观察。
1.4 统计学分析
实验数据以均数±标准差表示，采用SAS10.0统计软件的one-way ANOVA 及SNK-q检验对各组间差异进行分析，以α＝0.05作为检验水准。
2 结 果
2.1 中毒表现
A组大鼠毛色差，活动减少，消瘦；B组中1只大鼠于第2次灌胃后5 h死亡，其余动物毛色灰暗，反应呆滞，明显消瘦，运动失调，结膜及鼻孔出血。裂隙灯下各组动物角膜、前房、虹膜、晶状体未见特殊改变；直接眼底镜下A组动物出现视网膜血管轻度迂曲及点状出血，B组动物视盘边界不清，表面充血，视网膜灰白混浊，有点、片状出血，血管迂曲变细。C、D组动物毛色光滑，反应如常，眼底无异常改变。实验结束时，C、D组体质量无显著性差异；与对照组比较，A、B组体质量下降，差异有统计学意义（F=30.84，P< 0.0001，表1）。
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