作者：刘斌， 李永平， 张波， 张文忻， 彭展
【目的】 研究-70 ℃反复冻融体外杀伤人眼脉络膜黑色素瘤细胞系OCM-1的机制。【方法】 OCM-1细胞反复冻融后,用噻唑蓝比色法及克隆形成实验检测细胞的杀伤情况和细胞生长活力，免疫组织化学方法检测细胞P16表达的变化，电镜及共聚焦显微镜观察冻融后细胞凋亡和坏死的形态学改变，并测定细胞的凋亡比率，流式细胞仪检测冻融前后细胞CD40表达比率及细胞膜电位的变化。【结果】 噻唑蓝比色法检测及克隆形成实验显示，冻融可以直接杀伤OCM-1细胞，且残存的细胞生长能力也明显受抑制。免疫细胞化学染色见对照组的细胞呈P16阳性，而冻融后的细胞均呈阴性，冻融后培养的细胞部分呈阳性。电镜下观察到冰晶的结构特征及细胞的坏死和凋亡等变化。激光共聚焦显微镜观察发现凋亡细胞随着冻融次数的增加而增多。流式细胞仪测定显示冻融后细胞膜电位下降, 冻融前后CD40阳性细胞比率差异明显，且呈一定的量效关系。【结论】冻融不仅可以明显杀伤OCM-1瘤细胞，还能抑制残存瘤细胞生长。反复冻融能诱导大量的肿瘤细胞发生凋亡, 此为杀伤肿瘤及诱导肿瘤退变的直接原因，其机制与线粒体膜电位及P16表达下调有关。冻融后瘤细胞坏死因子CD40表达增强，可能是增强机体的免疫应答，介导机体免疫杀伤瘤细胞的机理。
【关键词】 反复冻融； 脉络膜黑色素瘤； 细胞凋亡； CD40; 线粒体膜电位
近年来,现代冷冻治疗技术因其治疗范围广、安全有效及微创等特点,在恶性肿瘤治疗中显示了令人鼓舞的应用价值[1,2]，已经成功地用于前列腺癌、气管内肿瘤、肝癌等治疗[3-5]。冷冻在一些恶性肿瘤的早中期治疗效果明显，并能有效治愈恶性肿瘤［６］。即便肿瘤发展到晚期甚至转移，当药物等常规治疗的手段效果非常有限时，冷冻治疗也能显示良好的效果［７］。临床治疗上，无限制的延长冷冻治疗的时间并不现实，时间越长对正常组织造成的损害也越严重，因此，冷冻治疗肿瘤采用的方法是快速冷冻、缓慢复温、反复多次冻融[8]。虽然冷冻治疗在临床上已广泛应用，但是反复多次冻融杀伤肿瘤细胞的机制并不十分清楚，研究其机制有助于我们在攻克肿瘤的治疗上取得进展。本实验针对冻融杀伤肿瘤细胞的机制进行研究，结果报道如下。
1 材料和方法
1.1 试剂
DMEM/F12(1 ∶ 1)培养基,胎牛血清（fetal calf serum FCS,）均购自Gibco公司。小鼠抗人P16，CD40单克隆抗体分别购于福州迈新公司和Chemicon公司。荧光染料Rhodamine 123为Sigma公司产品。FITC羊抗鼠IgG荧光二抗、Hoechst 33342染色剂均购自Dako公司。 仪器：美国ThermoForma生产-86 ℃超低温冰箱，型号:725。日本日立公司H-600型透射电镜。激光共聚焦荧光显微镜为德国Zeiss, LSM 510 Meta型。美国BD公司FACSAria型流式细胞仪和BD FACSiva software数据分析软件。
1.2 实验分组
调节细胞浓度为1×106/mL，取1 mL置入EP管，PBS洗涤，离心弃上清，置入超低温冰箱，调节温度为-70 ℃，每次冻融时间均为0.5 min，共分为1、2、3、5次共4组。细胞从冰箱中取出后均放于37 ℃水浴恒温器中，复温2 min，再进行下一次冻融。
1.3 噻唑蓝比色法检测
将细胞按上述冻融方法分别处理后，调节细胞浓度为1 × 105/mL，取80 μL加入96孔板中，加入培养液至180 μL，再加入( 3, 24, 5 dimethyliazol 22, 5 diphenyl tetrazolium bromide)MTT液20 μL, 每一处理条件设6个重复孔，并设阴性对照组及空白对照组。继续培养4 h后,弃去上清液,每孔加入二甲基亚砜（DMSO）200 μL,充分混匀,在酶联免疫检测仪上测定每孔的吸光度(A 值),波长为492 nm。计算细胞杀伤比率。
1.4 克隆（集落）形成实验
分别取对照组，冻融1、2、3、5次组的细胞，用台盼蓝染色方法记数500个活力好的细胞接种于100 mm培养皿中，并使细胞分散均匀,每组均用3个培养皿，置37 ℃、5%CO2培养箱静止培养14 d后，甲醇固定，苏木素染色。记数细胞数 >50为一个克隆，计算克隆形成率。
1.5 免疫细胞化学染色
细胞经冻融处理后，收集细胞，PBS洗涤，吹散，用微量加样枪滴片，风干，甲醇固定。3%H2O2封闭内源性过氧化物酶10 min，加血清并水浴10 min，加入一抗P16后，依次加入二抗，S-P/HRP复合物，上述步骤均以PBS缓冲液稍洗3次，DAB显色，Maye′s 苏木素复染细胞核，常规脱水、透明、封片。显微镜下观察。
1.6 透射电镜观察
细胞冻融处理后,收集细胞(细胞数量≥1 × 107 个/mL) 。加入PBS, 1000 r /min离心10 min（r=12 cm）,弃上清。放入预冷的2%多聚甲醛2戊二醛前固定液( pH 值为7.3 ) 中,4 ℃固定2 h, 再次离心后弃上清。制作电镜切片，在透射电镜下观察及拍照。
1.7 激光共聚焦显微镜观察
细胞经冻融处理后，收集细胞，PBS洗涤，吹散，用微量加样枪滴片，风干，甲醇固定。水洗3 min，用Hoechst 33342染色5 min，晾干，甘油封片。共聚焦显微镜下观察。
1.8 流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位的改变
细胞冻融处理后,收集细胞(细胞数量≥1 × 106)。洗涤2次,加入荧光染料Rhodamine 123至终浓度5 μmol/L, 于37 ℃、5%CO2 培养箱中负载细胞30 min后，再次洗涤2次,在流式细胞仪下,待荧光强度稳定后，每隔30 s计数10000个细胞，连续5次。荧光强度高低代表细胞线粒体膜电位的大小。
1.9 流式细胞仪测定CD40比率
细胞按上述方法冷冻后，收集细胞(细胞数量≥1 × 106)，每管加入100 μL含15%多聚甲醛的PBS，4 ℃固定15 min,离心,弃固定液。加入含10%FCS的PBS4 ℃封闭2 h，洗涤3次后,每管加入5 × g/mL的CD40单抗各100 ?滋L, 4 ℃孵育1 h，再次洗涤3次，于每孔中加入1 ∶ 1000稀释的FITC羊抗鼠IgG 作为荧光二抗，4 ℃作用0.5 h后取出，充分洗涤3次后，并设空白对照管，使用流式细胞仪检测，并分析数据。
1.10 统计学分析方法
实验的数据均使用ｘ±ｓ表示，SPSS 12.0软件对数据进行统计学分析。
2 结 果
2.1 细胞的杀伤比率
随着冻融次数增多，杀伤比率明显增加（表1）。
2.2 克隆形成实验结果
对照组细胞克隆形成较为均匀,克隆率为(27.3 ± 1.5)%。冻融后，细胞的贴壁能力及生长能力明显减弱。克隆形成较小，数目较少,并随着冻融次数的增加克隆形成的量进一步下降（表1）。
2.3 免疫细胞化学染色结果
对照组细胞P16阳性（图1A），而冷冻后的细胞均呈阴性（图1B），冷冻后培养的细胞部分呈阳性（图1C）。
2.4 电镜观察结果
对照组结构完整，细胞为不规则圆形或多角形，胞浆丰富，胞质均匀，胞质内有丰富的线粒体、粗面内质网、核糖体、高尔基器、溶酶体和微丝;核膜清晰,核大，核仁明显，能见到核分裂。冻融后的细胞内发现梭形，边界清晰，低密度的裂隙，为早期冰晶的超微结构（图2A）。镜下见大量不同时期的凋亡细胞及典型的凋亡小体(图2B)。坏死的细胞密度降低，细胞膜破裂，消失，细胞成分外溢，染色质、胞质均溶解；有的细胞仅余核仁和完整的核膜，其他细胞成分均消失。
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