赵武校 杜之渝 刘维锋 刘德杰
The inhibitory effects of tetradrine on rabbit corneal haze formation
after Epi-LASIK
Zhao Wuxiao，Du Zhiyu，Liu Weifeng，Liu Dejie．Department of Visual Science and Optometry Center，People’s
Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region，Nanning 530021，China
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Abstract Objective Epipolis laser in situ keratomileusis(Epi．LASIK)shows many advantages in the treatment 0f
myopia．But，how to prevent the haze after Epi—LASIK is still under investigation．This study was to investigate the inhibitory effect
of tetradrine on rabbit corneal haze formation and the expression of transforming growth factor beta 2(TGF—B。)in the cornea after
Epi—LASIK． M ethods Twenty—seven New Zealand white rabbits received bilateral 一10．00 diopters Epi—LASIK and were
randomly divided into self。control group，negative control(NC)group，tetrandrine(Tet)group and fluoromethalone group．Haze
grade was evaluated under the slim-lamp light at 0．5 months，1 month and 2 months postoperatively．Six corneas were harvested at
each time point in each group．TGF—p2 protein in cornea was detected by imnmnohistochemistry，and TGF．02mRNA expression in
cornea was determined by reverse transcription—polymerase chain reaction(RT—PCR)． Results Corneal haze grades at 0．5
months and 1 month after Epi—LASIK were significant different among the groups(P<0．05)．Compared with the NC group，haze
grades in Tet and fluoromethalone group were apparently lower(P<0．01)．No significant difference in haze grades was found
among the three groups at 2 months after surgery(F=3．033，P>0．05)．RT—PCR procedure showed that the levels of TGF—B，
mRNA in eornea in Tet and fluoromethalone groups were apparently lower than NC group(P<0．0 1)，but there was no significant
diference between Tet and fluoromethalone group(P>0．05)．Immunohistochemist y outcomes showed that the levels of TGF—B，
in Tet and fluoronmthalone groups were both much lower than NC group at various time points postoperatively(P<0．01)，but
there was no significant difference between Tet and fluoromethalone group(P>0．05)．The expression of TGF一132 began to ascend
at 0．5 months and peaked at 1 month and then descended at 2 months postoperatively． Conclusion Tet inhibits rabbit eorneal
haze formation after Epi—LASIK by downregulating the expression of TGF-132 in cornea．
Key words tetradrine； Epi-LASIK； haze； transforming growth factor beta 2

摘要 目的 探讨汉防己甲素(Tet)对兔微型角膜刀准分子激光上皮瓣下角膜磨镶术(Epi—LASIK)术后角膜上皮下雾状混浊(haze)形成的作用。 方法 健康新西兰大耳白兔27只，双眼行一10．O0 D Epi—LASIK手术，随机分为阴性对照(NC)组、Tet组、艾氟龙(FML)组，每组18只眼。于术后0．5、1、2个月在裂隙灯下进行haze分级评估。各时间点随机选取各组动物6只眼，利用逆转录聚合酶链反应(RT—PCR)和免疫组织化学法检测转化生长因子B (TGF—p )的表达。结果Tet组和FML组haze分级水平在术后0．5个月、1个月均明显低于NC组(P<0．01)，术后2个月3组间总体比较差异无统计学意义(P>0．05)。RT-PCR检测显示，术后各时间点Tet组和FML组TGF—B，mRNA的表达水平均明显低于NC组(P<0．01)。免疫组织化学检测显示，术后各时间点Tet组和FML组TGF一13 的表达水平均明显低于NC组(P<0．01)；TGF—p：的表达水平呈先上升后下降的特点，在术后1个月达高峰。 结论Tet能有效抑制兔Epi—LASIK术后haze的形成，可能是通过下调角膜TGF．B 的表达而发挥作用的。
关键词汉防己甲素；Epi—LASIK；角膜上皮下雾状混浊；转化生长因子B，分类号 R 779．63 文献标识码A 文章编号1003-0808(2009)07—0567—05

微型角膜刀法准分子激光上皮瓣下角膜磨镶术(epipolis laser in situ keratomileusis，Epi—LASIK)是近年来准分子激光角膜表面切削手术的一大亮点。临床资料显示，Epi．LASIK手术制作的上皮瓣基底膜完整、上皮细胞形态及活性接近正常 ～ ；手术安全有效、刺激症状和雾状混浊(haze)轻 ；术后角膜敏感度和泪液功能恢复较LASIK快 等诸多优点。但与准分子激光原位角膜磨镶术(1aser in situ keratomileusis，LASIK)相比，该术式仍未避免术后haze形成，尤其是高度近视术后haze的形成。目前临床主要使用糖皮质激素来抑制haze的形成，但使用过程中引起的角膜屈光术后皮质类固醇性高眼压也时有报道 。本研究旨在观察汉防己甲素(tetradrine，Tet)作为糖皮质激素的潜在替代药物用于抑制兔Epi—LASIK术后haze形成的作用机制，为该药在眼科的临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1．1 材料

1。1．1 实验动物 健康新西兰大耳白兔27只(重庆医科大学实验动物中心提供)，体重2．0～2．5 kg，雌雄不限，排除眼前节疾病，双眼行Epi—LASIK手术。

1．1．2 主要仪器与试剂 KM一5000D自动旋转式微型角膜刀(江苏无锡市康宁医疗电子设备开发公司)；准分子激光仪(美国VISX 公司)；离心机(德国eppendorf公司)；PCR仪、电泳仪和凝胶成像系统(美国BIO—RAD公司)；石蜡切片机(德国Leica公司)。速眠新Ⅱ注射液与苏醒灵注射液(长春军需大学兽医研究所)；倍诺喜滴跟液(日本参天制药株式会社)；艾氟龙(fluoromethalone，FML)滴眼液(美国Allergan公司)；0．1％Tet滴眼液及其阴性对照液(原料药Tet购自西安山川生物有限公司)。总RNA抽提试剂盒(德国QiaGen公司)，RT—PCR试剂盒(日本Takara公司)，兔抗兔转化生长因子p：(TGF—p：)多克隆抗体、免疫组织化学显色试剂盒(武汉博士德公司)。

1．2 方法

1．2．1 兔Epi．LASIK模型的建立实验兔术前2 d诺氟沙星滴眼液点眼，每日3次，手术当日林可霉素滴眼液冲洗结膜囊。速眠新Ⅱ注射液按0．1 mL／kg肌内注射麻醉动物，倍诺喜滴眼液表面麻醉。使用KM一5000D微型角膜刀制作上皮瓣，负压一60 mmHg(1 mmHg=0．133 kPa)，行光学切削区直径6．00 mm、矫正屈光度一10．00 DS的准分子激光切削后，PBS冲洗基质床并复位上皮瓣、点诺氟沙星滴眼液、佩戴角膜接触镜、于睑裂三等分处间断缝合睑缘2针。术毕苏醒灵注射液按0．I mL／kg肌内注射催醒。术后诺氟沙星滴眼液点眼，每日3次，至上皮愈合后取出角膜接
触镜。

1．2．2 实验动物分组及用药方案 实验动物27只(54只眼)，采用自身对照按眼别随机分为3组，分别为阴性对照(negative control，NC)组、Tet组、FML组，每组18只眼。NC组使用不含Tet的溶剂制成的滴眼液，Tet组使用浓度为0．1％ Tet制成的滴眼液，FML组使用0．1％FML滴跟液作阳性对照。滴眼液的使用方法：上皮愈合后开始用药，每日4次，逐月递减。各组按药物干预后不同时间点再细分为术后0．5、1个月及2个月组，每个亚组6只眼。

1．2．3 活体haze分级观察定期在裂隙灯下观察并记录兔Epi—LASIK术后haze分级情况。haze分级标准 ：角膜透明为0级；斜照法可见轻度混浊为0．5级；裂隙灯下易发现角膜混浊，不影响观察虹膜纹理为1级；角膜混浊，轻度影响观察虹膜纹理为2级；角膜明显混浊，中度影响观察虹膜纹理为3级；角膜重度混浊，不能窥见虹膜纹理为4级。

1．2．4 逆转录聚合酶链反应(reverse transcription andpolymerase chain reaction，RT—PCR)检测TGF-B，mRNA表达 空气栓塞法处死动物，手术刀片刺穿前房、眼科剪取角膜二等分，取其一半采用RNeasy Fibrous TissueMini Kit提取角膜的总RNA，紫外分光光度计于260 nm和280 nm处测量RNA的含量和纯度，甲醛变性凝胶电泳鉴定RNA的抽提情况。取l IxL总RNA按两步法RT—PCR操作步骤，先逆转录为cDNA，然后行PCR扩增。引物序列、产物及退火温度见表1，以甘油醛．3一磷酸脱氢酶(glyseraldehyde一3一phosphate dehydrogen—ase，GAPDH)作为内参照。2％ 琼脂糖凝胶电泳，GelDoc凝胶成像系统检测角膜组织TGF．B mRNA的表达。

1．2．5 免疫组织化学法 取另一半角膜组织常规石蜡切片、脱蜡至水、微波修复抗原、3％H 0：处理10 min阻断内源性过氧化物酶活性、正常山羊血清封闭，3 7 ℃ 孵育1 5 m i n 。加兔抗兔T G F ． B ， 多克隆抗体一抗( I ： 2 0 0 ) ， 4 ℃ 过夜。取出切片0 ． 1 m o l ／L P B S 冲洗5 m i n X 3 次， 加生物素化山羊抗兔I g G 二抗5 0 “ L ，3 7 ℃ 孵育2 0 m i n， 0 ． 1 m o l ／L P B S 冲洗5 m i n × 3 次。加链霉素抗生物蛋白一过氧化物酶溶液：加S A B C ，3 7 ℃ 孵育2 0 m i n， 0 ． 1 m o l ／L P B S 冲洗5 m i n × 4 次。D A B 显色。苏木素复染、脱水、透明、中性树胶封片，光学显微镜下观察。阴性对照采用P B S 代替一抗。
阳性结果判定：以胞浆或细胞外基质中出现棕黄色染色为阳性。

1 ． 3 统计学方法采用S P S S 1 3 ． 0 统计学软件进行统计学处理。各测试指标的数据资料以至- 4- S 表示， 计数资料采用F i s h e r 精确概率法检验；计量资料采用L e v e n e 检验进
行方差齐性检验， 对不同组的测试指标的总体比较采用单因素方差分析， 多组资料的两两比较采用S N K — q检验。P < 0 ． 0 5 表示总体比较差异有统计学意义， P <0 ． 0 1 表示三组之间两两比较差异有统计学意义。

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