作者：李雯霖　姜德咏　陈忠平　张莉 

    【摘要】目的：葛根素对人视网膜色素上皮细胞增殖及DNA合成的影响。方法：酶消化法分离人RPE细胞，进行形态学观察并用免疫组织化学法做抗人角蛋白抗体鉴定，取3～8代细胞用于实验。细胞计数法检测不同浓度（0，0.01，0.1，1g/L）葛根素作用24h和0.1g/L葛根素在不同时间（24，36，48，72h）对人RPE细胞增殖活性的影响，并计算出相应的细胞增殖抑制率。四唑盐（MTT）比色法检测葛根素作用24h对人RPE细胞增殖活性的影响。用3H胸腺嘧啶核苷（3H thymidine， 3H-TdR）掺入法检测葛根素作用24h对人RPE细胞DNA合成的影响。结果：葛根素以剂量和时间依赖方式抑制人RPE细胞增殖，经统计学分析，0.01g/L以上浓度葛根素均能显著抑制人RPE细胞增殖(P ＜0.01)及DNA合成(P ＜0.01)。结论：葛根素显著抑制人RPE细胞增殖及DNA合成。

    【关键词】  葛根素　药理学　视网膜色素上皮细胞　增殖

    Effect of puerarin on proliferation and DNA synthesis of human retinal pigment epithelial cells

    Abstract AIM: To investigate the effect of puerarin on proliferation and DNA synthesis of human retinal pigment epithelial (RPE)cells.  METHODS: Human RPE cells were cultured by enzymatic dissociation methods, the purity of cultured human RPE cells were assessed morphologically and confirmed by immunohistochemical staining for human cytokeratin, subcultures between 3 and 8(P3-8) were used in the study. Counting cell numbers was used to determine the effect of puerarin on the growth of human RPE cells at different concentration(0,0.01,0.1,1g/L) and for different time（24，36，48，72 hours）.The arrest rate of human RPE cell proliferation by puerarin was determined. The tetrazolium dye- reduction assay(MTT) was used to determine the effect of puerarin on human RPE cell surviral and proliferation for 24 hours at four concentrations. The [3H]thymidine incorporating was used to determine the effect of puerarin on the DNA synthesis of human RPE cells for 24 hours at four concentrations .RESULTS: Puerarin inhibited proliferation of human RPE cells in a dose and time-dependent manner in vitro. The inhibitory effect on the proliferation and DNA synthesis of human RPE cells was statistically significant at concentrations above 0.01g/L (P <0.01) .  CONCLUSION: Puerarin can significantly inhibit the proliferation and DNA synthesis of human RPE cells..

    · KEYWORDS: puerarin; pharmacology; retinal pigment epithelial cell; proliferation

    0引言

    增生性玻璃体视网膜病变（proliferative vitreoretinopathy,PVR）是一种常见的致盲眼病，细胞增殖是PVR的病理特征。视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞是参与 PVR中视网膜前膜（epiretinal membranes,ERM）的主要细胞成分。葛根素具有扩血管、促进血液循环、改善微循环等主要作用，已广泛用于临床，但有关葛根素的细胞作用研究报道不多。我们观察葛根素对人RPE细胞增殖活性的影响，以了解它的细胞抑制作用。

    1材料和方法

    1.1材料 葛根素为中国药品生物制品检定所提供的标准品，纯度大于99%；鼠抗人角蛋白mAb 、S-P超敏试剂盒及DAB显色试剂盒购自福州迈新公司；二甲基亚砜(DMSO) 和 MTT 购自Sigma公司；3H-TdR购自中国原子能研究所；胎牛血清购自杭州四季青生物工程有限公司。RPE细胞取自20～40岁意外死亡后12h内作角膜移植的供体眼（知情者同意）， 将视网膜色素上皮层剥离，用2.5g/L胰蛋白酶消化后，离心，弃上清液，用含200mL/L胎牛血清的DMEM（Dulbecco’s modified Eagle’s medium ）培养液重悬细胞，接种25mL培养瓶中，置于37℃、50mL/LCO2、950mL/L空气的孵育箱中孵育。细胞生长近融合时，按1：2传代，传代细胞用100mL/L胎牛血清DMEM继续培养，取3～8代细胞用于实验。用链霉亲和素-生物素化-过氧化酶法（SP法）行鼠抗人细胞角蛋白免疫细胞化学鉴定，获得纯度高达100%的RPE细胞。

    1.2方法 取4～6代RPE细胞用含100mL/L胎牛血清的DMEM制成5×107/L的细胞悬液，接种于24孔塑料培养板，孵育24h后弃上清液，分别加入终浓度为0.01，0.1，1g/L的葛根素且不含胎牛血清的DMEM液，对照组加入等量不含胎牛血清的DMEM培养液，培养24h，2.5g/L胰蛋白酶消化制成细胞悬液，台盼蓝染色计数，按如下公式计算不同浓度药物对细胞增殖的抑制率(%)=(1－实验组A均数/对照组A均数)×100%。另接种细胞孵育24h后弃上清液，加入终浓度为0.1g/L葛根素且不含胎牛血清的DMEM液，对照组加入等量不含胎牛血清的DMEM培养液,继续孵育24，36，48，72h计数，按上述公式计算不同时间药物对细胞增殖的抑制率。另接种细胞于96孔板中，孵育24h后弃上清液，加入不含胎牛血清的DMEM继续孵育12h，用于实验，分别加入终浓度为0.01, 0.1, 1g/L葛根素且不含胎牛血清的DMEM培养液，对照组加入等量不含胎牛血清的DMEM培养液，孵育24h，每孔加入5g/L MTT溶液20μL，继续培养4h，终止培养后，吸弃上清液，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)150μL终止反应，微型震荡器震荡10min，立即在酶联免疫仪上测定各孔的光吸收值，波长为490nm。计算药物对细胞增殖的抑制率。同上接种细胞于24孔培养板，孵育24h后弃上清液，分别加入终浓度为0.01,0.1,1g/L葛根素且不含胎牛血清的DMEM培养液，对照组加入等量不含胎牛血清的DMEM培养液，培养24h，每孔加入3H-TdR100μL,使之终浓度为3.7×1010Bq/L，继续培养12h，收集细胞于玻璃纤维膜上，进行漂洗、脱色、烤干，置入闪烁杯中，加入二甲苯闪烁液，用液体闪烁计数仪测定每分钟脉冲数(cpm)。以上各组实验均重复3次以上。

    统计学处理：所有数据均用SPSS11.0软件进行统计分析。数据以平均值±标准差( )表示，进行t检验和方差分析，显著性检验以P＜0.05有意义。

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