作者：韩小霞，惠延年，宋虎平，王海涛，张晓光，刘百军

    【摘要】  研究高浓度葡萄糖对体外培养人视网膜色素上皮（RPE）细胞细胞间黏附分子-1（ICAM-1）表达的影响。方法：用免疫荧光法检测5.6mmol/L和30.0mmol/L葡萄糖作用1，2，3d后 hRPE细胞表面ICAM-1表达量，MTT方法检测两种浓度葡萄糖作用下48h hRPE表面黏附白细胞的数量。结果：30.0 mmol/L葡萄糖作用1，2，3d后 hRPE细胞表面荧光着色密度分别为5.6mmol/L葡萄糖作用下荧光着色的2.4，3.8，4.0倍。30.0mmol/L葡萄糖作用48h后hRPE细胞表面黏附的白细胞数量是5.6mmol/L葡萄糖组的2.34倍，有统计学显著性差异（P ＜0.05）。结论：高糖可以促进体外培养hRPE细胞的ICAM-1表达，提示RPE细胞在高糖作用下可能参与了糖尿病视网膜病变的早期病理反应。

    【关键词】  人视网膜色素上皮细胞

    0引言

     近年的研究表明，糖尿病发病机制中有低度慢性炎症反应参与，白细胞通过细胞间黏附分子（ICAM-1）引起在视网膜附着和活化，造成视网膜微血管渗出等炎症改变。其中高浓度葡萄糖的直接作用也得到研究者的证实[1]。高糖可以抑制微血管内皮细胞的增生[2]，降低细胞连接蛋白的表达量，从而使细胞的形状发生改变，使大分子物质突破内皮细胞屏障[3]。视网膜色素上皮细胞作为视网膜的外屏障，转运大量葡萄糖为视网膜神经感觉层提供能量[4]，更受到血糖波动的影响，发生病理和功能的改变。但是在体外研究中有关RPE细胞在高血糖的作用下的改变还少有报道，我们研究高浓度葡萄糖对体外培养的人视网膜色素上皮ICAM-1表达的影响，探讨RPE细胞是否参与早期DR病变的病理变化过程。

    1材料和方法

    1.1材料  我们以角膜移植供体眼做原代培养人RPE（hRPE）细胞，建立有限hRPE细胞系, 采用第3～6代细胞作为实验细胞[5]， 抗人角蛋白抗体和KG8.13抗体免疫组织化学染色鉴定细胞。细胞培养采用正常浓度葡萄糖Dulbecco改良的Eagle培养基（Dulbecco’s modified Eagle’s medium, DMEM）干粉（Gibco公司，葡萄糖浓度：5.6mmol/L）；每袋正常葡萄糖浓度DMEM培养基干粉添加24.4mmol D-葡萄糖（Sigma公司），配制成含高浓度葡萄糖的DMEM培养液（葡萄糖浓度：30.0mmol/L）。

    1.2方法

    1.2.1 MTT比色法  绘制正常浓度葡萄糖培养液及高浓度葡萄糖培养液培养的hRPE细胞生长曲线。取近铺满的RPE细胞用2.5g/L胰酶消化后，以含100mL/L新生牛血清（四季青公司）正常浓度葡萄糖 DMEM细胞培养液重悬，5×106/L的密度接种于96孔板，待24h细胞贴壁伸展后，换用含不同浓度葡萄糖（Ⅰ组5. 6mmol/L，Ⅱ组30.0mmol/L）DMEM细胞培养液在37℃、5mL/L CO2孵箱中培养， 每2d更换培养液，每组设有3个副孔。每24h随机选择一块96孔板，每孔加入5g/L的MTT（Sigma公司）溶液200μL，孵箱孵育4h，吸出上清，加入二甲基亚砜（DMSO）20μL，在摇床上震荡10min，设空白对照孔，于酶标仪上用490nm波长读取吸光度，根据每组吸光度平均数值描绘细胞生长曲线[6]。

    1.2.2免疫荧光法检测hRPE细胞ICAM-1的表达  RPE细胞消化后，以5×106/L的密度接种40μL细胞悬液于预先放置在24孔培养板中的8mm×8mm盖玻片上，4h后加含100mL/L灭活小牛血清的DMEM正常浓度葡萄糖培养液1mL，在37℃、50mL/L CO2孵箱中培养24h后，按不同组分别添加含5.6mmol/L，30.0mmol/L 葡萄糖的DMEM培养液，每组包括6个培养孔，每2d更换培养液。每天分别取出不同组细胞爬片，0.01mol/L PBS洗2次，950mL/L酒精-20℃固定20min，空气干燥，-20℃保存。固定的细胞爬片恢复至室温，经0.01mol/L PBS反复冲洗，滴加5mL/L H2O2 /甲醇室温孵育30min以灭活内源性过氧化物酶，蒸馏水冲洗后0.01mol/L PBS震洗，滴加1∶50正常羊血清，室温放置30min，倾去，滴加鼠抗人ICAM-1 mAb( Santa Cruz公司，1∶50)，湿盒内4℃过夜，PBS漂洗3min，3次，滴加荧光素标记羊抗鼠IgG ( Santa Cruz公司，1∶50) ，37℃放置30min后，PBS漂洗3次，每次5min。缓冲甘油封片，荧光显微镜下观察、照相。同时设PBS替代第一抗体的空白对照和正常羊血清（中山公司，1∶50) 替代第一抗体的替代对照。

    1.2.3 RPE细胞表面白细胞黏附率实验  RPE细胞准备同前，调整细胞密度至1×108/L，200μL /孔接种于96孔培养板，24h后按分组（Ⅰ、高糖组 Ⅱ、正常葡萄糖组 Ⅲ、蔗糖组）更换30.0mol/L葡萄糖、5.6mmol/L葡萄糖DMEM培养液及5.6mmol/L葡萄糖+24.4mmol/L蔗糖培养液，培养48h。设置空白对照孔和RPE细胞对照孔。取健康成年人外周静脉血，肝素抗凝，加等量30g/L明胶，37℃静止沉淀1h，取上层液加入D-Hanks液2 000r/min离心，去上清，重复洗两次，Hanks液重悬，调整细胞浓度至1×109/L。按2×105/孔加白细胞悬液至96孔板，37℃孵育30min，摇床上轻摇1min，吸除未贴壁细胞，重复1次，行MTT比色实验：贴壁细胞的吸光度值（△A）＝各组细胞的吸光度值（A）-RPE细胞基础吸光度（A０），所得数值经统计学分析，做组间比较[7]。

     统计学处理：采用SPSS10.0 统计软件,数据以x±s表示，采用t检验进行统计学分析。P＜0.05有统计学意义。以上实验均重复3次。

    2结果

     刚接种的原代RPE细胞含有较多的黑色素，看不到细胞核。RPE伸展成椭圆形、多边形后，可见透明的细胞核。培养中黑色素粒逐渐脱失，至3代，黑色素粒基本不见（图1）。

    2.1 MTT比色实验结果  高糖组hRPE细胞生长曲线较正常浓度葡萄糖组细胞生长曲线为低，但统计学分析组间无明显差异（P＞0.1，图2）。

    图2  5.6mmol/L、30.0mmol/L葡萄糖作用下hRPE细胞生长曲线

    2.2免疫荧光染色  在蓝绿激光激发下，正常浓度葡萄糖培养液组的细胞膜和胞质着较浅的绿色荧光，高糖培养液组的细胞质及胞膜均有明显的荧光着色，细胞核不着荧光。空白对照和替代对照组的细胞无荧光着色。应用Image pro-plus 5.0软件做图像分析处理: 正常浓度葡萄糖组细胞微量表达荧光（0.6146±0.0989），且3d间荧光变化无统计学意义（P＞0.1）。高糖组细胞荧光染色强，而且随时间延长而增强：1，2，3d荧光密度分别是第1d正常葡萄糖组的2.4，3.8，4.0倍（图3，4）。高糖组荧光染色强度高于正常浓度葡萄糖组，且组间差别有统计学意义（P＜0.05＝。

    图3 hRPE细胞抗ICAM-1荧光着色

    A:正常浓度葡萄糖组；B:高糖组

    图4 不同浓度葡萄糖培养液2d hRPE细胞荧光着色×200

    2.3 RPE细胞表面黏附WBC细胞数量  高糖组hRPE细胞上黏附的外周血白细胞吸光度（0.07867±0.00568）高于正常浓度葡萄糖组(0.03367±0.00568)1.34倍（P＜0.01），而作为渗透压对照的5.6mmol/L葡萄糖+24.4mmol/L蔗糖组，白细胞的吸光度（0.04005±0.00784）与正常浓度葡萄糖组没有显著性差异（P＞0.2）。

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