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2结果
2.1 MSC生长特征 培养3d细胞开始伸展，换液去除未贴壁细胞可见贴壁生长的MSC数量较少，散在分布，体积较大，呈纺锤形或梭形。7d后开始出现较大的克隆，贴壁细胞迅速增殖，为成纤维细胞样，胞质丰富，核大，贴壁牢，不易消化(图1)。14d后细胞融合，呈漩涡状排列(图2)。培养的大鼠原代MSC表达间质细胞标记CD29（图3），不表达造血干细胞标记CD34，CD45，角蛋白K12染色阴性，符合骨髓MSC特征。
2.2角膜基质细胞的形态特征 培养2d可见细胞伸展，呈梭形或不规则三角形。细胞核为椭圆形位于中央，细胞质向外伸展突起。3d后，细胞数量逐渐增多，呈放射状排列生长。原代细胞培养7d，细胞达融合状态(图4)。传代后细胞生长迅速，约5d左右融合。将第2代的细胞用于共培养体系。
2.3 MSC共培养后特征 诱导组MSC经7d的共培养诱导，大部分细胞体积变大，细胞呈多角形，细胞质比例明显增大，分化为间质细胞，小部分细胞形态上相对偏小，细胞核明显，散在分布(图5)。免疫荧光检测这部分细胞表达角膜上皮细胞特异性标志角蛋白K12，周围未染色细胞为分化为间质的细胞(图6)。对照组MSC细胞体积变大，细胞进一步融合呈漩涡状排列（图7）。免疫荧光染色检测不表达角蛋白K12（图8）。
图1 体外培养的大鼠原代骨髓MSC，呈成纤维细胞样，纺锤形或梭形（7d×200）
图2 融合后的大鼠原代MSC，呈漩涡状排列（14d×100）
图3 体外培养MSC CD29表达阳性（IF×100）
图4 体外培养的大鼠角膜基质细胞（7d×100）
图5 共培养诱导后的MSC（7d×200）
图6 共培养诱导后的MSC K12阳性（IF×100）
图7 对照组未诱导的MSC（7d×100）
图8 对照组未诱导MSC K12阴性（IF×100）
3讨论
眼表由角膜上皮、结膜上皮和泪膜3部分组成，眼表的稳定对维持角膜的透明性具有非常重要的作用。其中，角膜上皮细胞再生的来源是角膜缘干细胞，干细胞缺失会导致严重的眼表异常，进而造成角膜混浊，危害视力。目前，对这类疾病尚无理想的治疗方法。 临床采用自体角膜缘干细胞移植对部分患者有良好疗效，但是，当双眼均发生大面积眼表损害时，健康角膜缘干细胞的来源受限[1,2]。近年研究发现，成年人骨髓中存在着具有多向分化潜能的 MSC[3]，在体外不同条件下可以定向地被诱导分化为心肌细胞、脂肪细胞、上皮细胞、内皮细胞、神经细胞、骨、软骨、肌腱及骨髓基质等不同细胞[4-6] 。这类细胞来源确切、充足，取材方便，分化潜能大，避免了胚胎干细胞可能面临的伦理学问题，并且因为是自体组织，所以不存在排斥反应，可能具有更加良好的应用前景。研究表明，角膜基质是角膜上皮细胞和角膜缘干细胞的微环境，具有维持角膜上皮细胞特性的作用，特别是角膜缘基质维持角膜缘干细胞特性的作用是肯定的[7]。角膜缘基质含有多种自分泌和旁分泌细胞因子及其受体，共同组成了角膜缘基质层复杂的细胞因子调控微环境，维持角膜缘干细胞的正常分化、繁殖和不进入终极分化，在角膜缘永存。以往国内外研究多采用角膜缘干细胞作为眼表重建组织工程的种子细胞，虽然角膜缘干细胞作为种子细胞的研究已得到相当的进展,但其部位的局限性以及材料的难获得性限制了进一步的研究。本实验旨在为角膜的组织工程寻找更多更好的种子细胞，尤其是当眼表严重损伤，角膜缘细胞完全或大部分丧失不能修复眼表，用骨髓MSC替代角膜缘细胞进行移植具有重要的临床应用价值。利用角膜基质细胞模拟角膜缘干细胞生长的微环境与MSC在Transwell体系中共培养，诱导MSC向角膜上皮细胞分化，国内外尚未见报道。角膜基质具有诱导非角膜细胞向角膜上皮细胞分化的能力[8]，运用Transwell共培养体系能较好的模拟体内生长环境，上下层细胞不发生直接接触，0.45μm孔径的聚碳脂膜可以保证细胞因子正常通过而细胞不会通过，因此不会发生细胞间的污染。基质细胞分泌的细胞因子及外源性细胞因子（EGF）共同组成了MSC分化所需的复杂细胞因子调控微环境，促进MSC向角膜上皮分化。共培养后的细胞可以表达角膜上皮特异性角蛋白K12，说明在特定的条件下，MSC可以向角膜上皮定向分化。我们利用组织工程技术体外培养MSC，与角膜基质细胞共培养诱导MSC向角膜上皮转化，体外重建角膜上皮组织, 为进一步行组织工程化角膜上皮层移植奠定了理论和实验基础，为角膜组织工程中种子细胞的来源开辟了一个新的途径，然而其具体的分子机制仍有待进一步的研究。
【参考文献】
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2 Tsai RJ, Li LM, Chen JK. Reconstruction of damaged corneas by transplantation of autologous limbal epithelial cells. N Engl J Med ,2000;343:86293
3 Pittenger MF. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science,1998;284:1432147
4 Krause DS. Multi-organ, multi-lineage engraftment by a single bone marrow derived stem cell. Cell, 2001;105:3692377
5 Jiang Y, Jahagirdar BN, Reinhardt RL, Schwartz RE, Keene CD, Ortiz-Gonzalez XR, Reyes M, Lenvik T, Lund T, Blackstad M, Du J, Aldrich S, Lisberg A, Low WC, Largaespada DA, Verfaillie CM. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature,2002;418:41249
6郑健樑,杨玉霞,张平,林健贤,张文忻.成年大鼠骨髓间充质干细胞的体外培养及生物学特性.国际眼科杂志,2006;6(3):562-564
7燕振国,张继增,曹正荣. 角膜细胞外基质及其生物学作用. 国外医学生理病理科学与临床分册,1995;15:11213
8 Kurpakusm A, Stock EL, Jones JC. The role of the basement membrane in differential expression of keratin proteins in epithelial cells . Dev Biol ,1992;150 (2):243-255 上一页 [1] [2] |
