作者：许志洋 姚家奇 刘庆淮 李建民 王 强
作者单位：（210029）南京医科大学1中心实验室；4细胞生物学系;2（213003）中国江苏省南京市，南京医科大学附属医院常州第二医院消化内科；3（210029）中国江苏省南京市，南京医科大学一附院眼科
【摘要】 目的：通过检测17AAG对人RPE细胞不同处理条件下mRNA的SYBR Green实时PCR方法,观察17AAG对人RPE细胞中PDGFR和EGFR基因表达的调控。
方法：体外培养人RPE细胞株。当加入17AAG并作用0，2，5，10μmol/L及0，16，24，48h后,收集细胞,抽提RNA进行反转录。同时根据PDGFR、EGFR的基因序列,设计PDGFR、EGFR的引物,利用ABI 7300PCR仪和SYBR Green,建立实时荧光PCR反应条件,通过比较Ct值进行基因表达的相对定量分析。
结果：熔解曲线分析和琼脂糖凝胶电泳结果证明了PCR反应的特异性;相对定量结果显示,17AAG可以下调PDGFR基因的表达(P<0.05),上调EGFR基因表达(P<0.05)。
结论：SYBR Green实时荧光PCR可特异、准确地分析RPE细胞相关增殖基因表达差异,为系统研究17AAG治疗PVR的复杂调控机制创造有力条件。
【关键词】 SYBR Green 实时荧光PCR 17AAG 视网膜色素上皮细胞 增生性玻璃体视网膜病变 热休克蛋白90
0引言
增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy, PVR)是孔源性视网膜脱离或视网膜脱离复位术后的主要并发症和手术失败的主要原因,严重影响视功能的恢复。其发病机制尚未完全明确,目前多数认为一些眼内细胞的去分化、增生和迁移在PVR的发生发展中起着重要作用，其中，视网膜色素上皮（retina pigment epithelia, RPE）细胞是起主导作用的细胞[1]。PVR的机制可能是眼内炎症诱发细胞过度增殖,其发生发展与炎症密切相关。寻找能同时抑制炎症和抑制RPE细胞增殖的药物可能是防治PVR的有效途径。目前的研究主要集中在抗肿瘤药物上，但多数因为毒性大或效果不佳而无法用于临床。17AAG（17丙烯胺基,17去甲氧基格尔德霉素）作为一种新的Hsp90抑制剂，国内外许多文献报道其有很强的抗肿瘤作用，而且毒性较小[2]。最近已经进入临床II期实验。17AAG抑制肿瘤细胞增殖，也可以通过caspase途径导致细胞凋亡，或者抑制细胞周期相关蛋白,导致细胞周期阻图1 PDGFR、EGFR、β Actin熔解曲线示意图
图2 定量PCR产物电泳图
滞等。其机制可能是抑制Hsp90的功能，导致Hsp90与效应蛋白的解离；而Hsp90的效应蛋白超过100种，其中很多是细胞生长因子受体，如PDGFR（血小板源性生长因子受体）和EGFR（表皮生长因子受体），进而调控下游细胞信号转导通路[3]。研究结果表明PDGF和EGF等生长因子在PVR的发生发展中起重要作用，可促使RPE细胞、视网膜神经胶质细胞迁移和增殖[4]，可能通过作用于酪氨酸激酶受体PDGFR和EGFR参与调控RPE细胞增殖信号通路的关键信号分子，如Akt和Raf。这些信号分子在RPE细胞增殖过程中发挥重要作用[5]。我们发现17AAG对RPE细胞中的Akt和Raf信号分子以及Hsp90的表达均有不同程度的抑制，因此我们进一步对信号通路上游与RPE细胞增殖密切相关的生长因子及其受体进行研究，观察17AAG对RPE细胞的抑制作用，并用定量PCR的方法检测17AAG对PDGFR和EGFR的影响。从而探索17AAG用于治疗PVR的可能性。
1材料和方法
1.1材料 人视网膜色素上皮细胞株ARPE19（ATCC公司），DMEM/F12培养基（Hyclone公司）和100mL/L胎牛血清（Gibco公司）。总RNA抽提试剂采用Invitrogen公司的Trizol Reagent,Power SYBRGreen PCR Master Mix为Applied Biosystems 公司产品。
1.2方法 细胞培养使用人视网膜色素上皮细胞株ARPE19，培养基为DMEM/F12和100mL/L胎牛血清，加100mg/L青霉素和链霉素，置于37℃含有50mL/L CO2的饱和湿度培养箱中。将17AAG(Sigma公司)溶于1000g/L DMSO。等细胞处于对数生长期时加入2，5，10μmol/L 17AAG，对照组加入等量1000g/L DMSO，作用24h收集细胞。另按5μmol/L处理16，24，48h细胞分为3组,对照组加入1000g/L DMSO。收集处理组和对照组的细胞(约1×107),分别加入50g/L Trizol 1mL ,按试剂说明书中的操作步骤进行RNA提取,加无RNA水，70℃保存。琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测抽提RNA的质量和浓度。用MMLV反转录酶将RNA反转录成cDNA,反应体系25μL包括RNA 2μg,反转录酶 1μL,RNase抑制
表1 PCR引物及产物大小
基因引物大小PDGFR1F5GAGGAGACCATCGCCGT3130bpPDGFR1R5TCACAATCACCAACAGCACC3EGFRF5GCTCTACAACCCCACCACG3184bpEGFRR5GCACTTCTTACACTTGCGGA3βActinF5TGGACATCCGCAAAGACC3306bpβActinR5TCAAGAAAGGGTGTAACGCA3剂1μL, 随机引物( 0.5μg) 1μL, 5×buffer 5μL 以及2mmol dNTP 6.25μL ,37℃水浴1h合成的cDNA置20℃保存备用。根据PDGFR、EGFR的mRNA基因序列, 用PrimerPremier 5.0引物设计软件设计两对引物(表1)。三对引物都扩增出了特异性的产物,其峰值所对应的温度与预期产物的Tm值一致,未出现其它异常波形,波的形状也较锐利（图1）。
SYBRGreen实时定量PCR 20μL反应体系包括: cDNA 2μL, 2×POWER SYBRGreen PCR Master Mix 10μL, 上下游引物各 5pmol。反应在专用的96孔板上进行,用专用的透明膜覆盖于板上,使反应体系密闭于反应孔中,设置PCR 反应程序: 50℃ 2min 激活UNG酶去除残余的产物污染,95℃ 10min 激活Taq Gold酶,开始扩增,95℃15s 变性,60℃ 1min 退火及延伸,重复40个循环。在60℃ 1min收集荧光信号，循环结束后执行熔解曲线程序。反应结束后每个反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，琼脂糖凝胶电泳结果显示RTPCR 反应所得的产物条带与预期的扩增产物长度一致,无明显杂带（图2）。
统计学处理：实时PCR的结果以Ct值表示。相对定量采用比较Ct法,根据等式Fold=2△△Ct来计算处理组和对照组之间目的基因的相对表达差异,△△Ct值表示处理组和对照组间的△Ct值差异,计算结果以两组间目的基因拷贝数的比值,即Fold值来表示。17AAG处理组和对照组间的目的基因比较采用REST2005统计软件进行处理和分析，包括标准误，95%可信区间，概率P值，变化倍数等。图3 PDGFR和EGFR的mRNA表达变化 A:PDGFR、EGFR随浓度梯度mRNA表达变化；B:PDGFR、EGFR随时间梯度mRNA表达变化
图4 光镜下在5μmol/L 17AAG处理后48h RPE细胞 A：（×50）；B：（×100）箭头所指为凋亡细胞
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