作者：朱良勇，贺自力

　　【关键词】  角膜缘；干细胞；体外培养；眼损伤

　　角膜上皮细胞具有自我更新的能力，眼表的正常结构和功能的维持有赖于角膜缘干细胞的不断分化、增殖、移行来完成。随着眼表疾病研究有突破性进展，角膜缘干细胞在眼表中的重要性越来越受到人们的重视，角膜缘干细胞体外培养的研究也日渐增多。笔者现就角膜缘干细胞的体外培养与临床应用作一综述。

　　1  概述
    　　
　　角膜缘干细胞是角膜上皮增殖、分化、移行的源泉。角膜缘干细胞具有其他干细胞所具有的特殊的生物学特性，并通过向心性移动和角膜上皮基底细胞的分裂、迁移，来补充角膜表面脱落的上皮细胞，完成上皮细胞的更新这一动态的平衡过程。目前认为角膜缘Vogt栅栏内的网状嵴上皮是角膜上皮干细胞的位置所在。1971年Davanger等［1］提出角膜缘Vogt栅栏的概念并观察到此处细胞向角膜中心水平移动。1986年Schermer等［2］利用特异性64KD角蛋白（K3）的手段，正确定位角膜缘上皮干细胞的存在。1987年Ebato等［3］通过比较角膜不同部位细胞在体外培养的生长情况，也进一步证实角膜上皮干细胞位于角膜缘处。
    　　
　　角膜缘干细胞的确定和经过不断的探索研究，发现角膜缘干细胞具有以下特点［4］：①位于角膜缘基底部，占整个角膜上皮细胞的0.5%～10%；②具有水平向心运动和垂直向上运动；③增殖力高，细胞周期长，分化程度低，不对称分裂；④不表达角蛋白K3；⑤含有丰富的蛋白酶：α-烯醇酶、细胞色素氧化酶、碳酸酐酶等；⑥角膜缘上皮细胞正常处于G1晚期，细胞富含周期蛋白A、D、E和增殖细胞核心抗原。

　　2  角膜缘干细胞的获取和分离

　　角膜缘干细胞的正确定位，使获得干细胞作体外培养成为可能。

　　2.1  取材

　　动物取材在全身麻醉下进行，用1/1000络合碘消毒眼周，冲洗眼球后用手术刀从角膜缘切取组织块。尸体取材时，在死亡后6h内取下眼球，剪取角膜缘内外各1mm角膜缘组织，去除多余结膜组织和基质层。用含双抗（105u/L青霉素加100mg/L链霉素）Hank液漂洗备用。

　　2.2  角膜缘干细胞的分离和培养

　　常用的分离方法有组织块直接培养、消化法及两种方法同时应用的混合法。

　　2.2.1  组织块培养法

　　将上述组织块剪成1mm×1mm×1mm大小，放入含少量纯胎牛血清培养瓶中密闭2h，缓慢加入少量培养基，37℃，5%CO2，95%湿度孵化箱过夜，次日补加培养基。接种后3天首次换液，以后隔日换液，每日倒置显微镜观察。此法操作环节少，细胞损伤小，可减少污染机会。但培养时间长，细胞成分复杂，常混有纤维细胞，分离和纯化较困难。

　　2.2.2  酶消化法

　　将组织块剪成2mm×2mm大小，Hank液冲洗2次，1.25g/L胰蛋白酶与0.2g/L EDTA 1∶1混合为消化液，用量为组织量的30～50倍，消化10～15min到组织块疏松，弃去消化液。Hank液冲洗2次，消除EDTA消化作用，加入等量200ml/L胎牛血清的细胞培养液终止胰蛋白酶消化。吸出培养液后再加入新的培养液2次，消除残余消化作用。然后加入培养液进行吹打使细胞分散，1000r/，离心5min，取重悬细胞以100×106/L接种量移入有孔培养板进行培养。此法可在较短时间内获得细胞进行培养和研究，但操作复杂，对消化时间和温度的控制有较高的要求。

　　2.2.3  混合法

　　即上述两种方法同时使用。组织块消化后所得的细胞悬液移入培养器进行培养的同时，将组织块也一起移入同时培养。此法培养的细胞易存活，形成膜片时间短，获得的细胞中含有少量纤维细胞，既能增加上皮膜片的张力强度，又能起到“饲细胞”的作用，促进细胞生长，有利于细胞成膜生长进行移植研究。

　　3  培养基的选择
    　　
　　角膜缘干细胞在体外培养时具有极高的增殖潜力。由于各人采用的培养基不同，增殖力亦有所不同。目前用于角膜缘干细胞的基础培养液主要有DMEM、DMEM/F12（1∶1）、M199、M199/F12（1∶1）、PRMI-1640等。目前大多采用DMEM/F12（1∶1）及添加激素的上皮细胞培养液(SHEM)做基本培养基，加入10%小牛血清，0.3mg/ml谷氨酸胺，0.1u/ml胰岛素，0.5μg/ml氢化可的松，10ng/ml表皮生长因子，0.18mmol/L腺嘌呤，0.1mg/L霍乱毒素等。但何种培养基最适于培养角膜缘干细胞，目前尚无报道。
    　　
　　血清成分复杂，含有一定的细胞毒性物质和抑制物质，对细胞有去分化作用，影响某些功能的表达，对角膜上皮细胞的生长具有抑制作用，含血清培养基仅能促进角膜缘干细胞的增殖，故只适宜于角膜缘干细胞的培养与分离。将角膜缘干细胞培养为上皮细胞并用于临床治疗眼表疾病，多采用无血清培养基。目前用于角膜上皮细胞培养的无血清培养基有MCDB153，EpilifeTM，无钙高糖的DMEM等，并添加胰岛素、转铁蛋白、氢化可的松及硒、钙等。这样的培养基适合瞬时扩充细胞的增殖［5］。

　　4  影响干细胞体外培养的因素
    　　
　　角膜缘干细胞在体外培养的增殖、粘附、生长速度受各种接触因子、接触底物等因素的影响。众多研究表明，钙离子浓度<0.08mmol/L时，可防止细胞的生长抑制，刺激增生，细胞常呈悬浮生长，钙离子浓度>1mmol/L时，细胞常贴壁生长，形成单层，产生抑制。细胞外钙离子浓度的升高，刺激TCA的增生，但不促进细胞分化［6］。国内才喻等［7］将无钙培养液与低钙培养相结合，获得较纯的、未分化的角膜缘干细胞。添加0.1mg/L霍乱毒素可增加细胞cAMP的合成，增加细胞的粘附能力。胎牛血清能促进角膜缘干细胞的生长，但抑制角膜上皮细胞的增殖。氢化可的松浓度<1μg/ml时可促进角膜缘干细胞的增殖；浓度>5μg/ml时则抑制干细胞的增殖。国内外研究表明［8］，表皮生长因子（EGF）、肝细胞生长因子（HGF）、碱性纤维母细胞生长因子（bFGF）、角质细胞生长因子(KGF)能促进细胞有丝分裂和细胞移行，促进干细胞的增殖。
    　　
　　除改变培养基中的化学成分会影响干细胞的增殖外，基质对干细胞亦有调节作用。使用成纤维细胞作为饲细胞进行培养，可促进干细胞的增殖。Tseng等［9］用3T3作为饲细胞进行培养，发现3T3可提高角膜缘干细胞的克隆形成率，作者认为是成纤维细胞可产生抗凋亡因子，通过上皮-基质的相互作用调节干细胞的增殖。张胜［10］等利用经丝裂霉素处理的人胚肺成纤维细胞作饲细胞，可明显提高干细胞的增殖能力。
    　　
　　另外，上皮干细胞的培养环境对细胞的增殖、分化也起重要作用。细胞层处于气液交界面时可快速增殖和分裂，有利于形成复层生长，利于临床应用的研究。

　　5  培养载体的选择
    　　
　　培养的角膜缘干细胞形成的上皮细胞膜张力低，无法直接用于临床移植，需要借助一定的载体才能移植至受体角膜。理想的载体应具有良好的生物相容性，能与受体组织融合，透明，具有一定的张力和韧性，能促进干细胞的增殖、分化、粘附，便于进行移植。角膜接触镜、合成胶原、角膜基质、人羊膜等都曾被用于试验。

　　5.1  角膜接触镜
 
　　Pellegrini等［11］以治疗性亲水性软性角膜接触镜为载体，将角膜缘干细胞体外培养、扩增后移植到眼表损伤者进行治疗并获得成功。

　　5.2  合成胶原

　　胶原作为载体，除提供干细胞生长的支架外，对细胞的功能和形态也产生作用。在体外条件下角膜缘干细胞可在Ⅳ型胶原上分化为复层结构。但胶原存在透明度差、抗拉力低，易降解等缺点，目前尚无用于临床移植的报道。

　　5.3  角膜基质

　　角膜基质作为载体，可通过基质的作用促进干细胞的增殖、粘附、分化和生长，同时又具有透明性好，抗拉力强，通透性高，抗原小等特点，在移植时还可以替代浅层病变的角膜基质。实验证明［12］，培养的干细胞在角膜基质上呈分层生长，细胞增殖和分化良好，体外生存时间长。在形态、组织结构、超微结构等方面，与正常角膜上皮非常相似。

　　5.4  人羊膜

　　培养干细胞所用和羊膜为去除上皮的人羊膜。相对于其他载体，人羊膜具有特殊的特点和生物学特性：①羊膜基底层与眼表上皮基底层组织成分相似；②羊膜含有多种细胞生长因子；③低抗原性和抗微生物性；④具有抗炎、抗纤维化、抗新生血管的作用；⑤去除上皮的羊膜无羊膜细胞，不表达HLA抗原，术后不会发生免疫排斥反应；⑥易取得，透明，张力强度大，便于移植。以羊膜为载体进行干细胞培养，可促进细胞移行，增强细胞粘附，促进上皮化的发生，细胞生长迅速。Schwab［13］分别用人羊膜、角膜基质、Ⅰ型胶原膜、软性角膜接触镜作为载体培养扩增角膜缘干细胞，进行自体和同种异体移植治疗，表明羊膜作为载体可以改善角膜上皮细胞的结构，使角膜重新上皮化。国内的实验也得到了类似的结论［14］。表明羊膜是角膜缘干细胞体养的良好底物，优于角膜基质和胶原板层，是干细胞体外培养和临床移植研究的首选载体。

　　6  体外培养的角膜缘干细胞生物学鉴别
    　　
　　目前尚未发现角膜缘干细胞的特异性标记物，体外培养角膜缘干细胞的鉴别主要是根据其生长特征、克隆形状及分化标记物进行鉴别。

　　6.1  PAS染色检查

　　PAS能特异性地与结膜上皮杯状细胞分泌的粘蛋白糖基部分结合，结膜上皮细胞染色阳性，而角膜上皮细胞染色阴性。阴性可以证明所培养的细胞属角膜上皮细胞表型。

　　6.2  免疫组化染色检查 
　　
　　即AE1、AE5检测。 AE1和AE5分别特异性识别包括48kD的一组酸性角蛋白和64kD的碱性角蛋白。单克隆抗体AE5即针对64kD角蛋白特异性抗体，结膜上皮表达阴性，角膜上皮包括基底细胞染色阳性，角膜缘仅基底细胞阳性，而基底层上细胞阴性。因此认为，未表达64kD角蛋白的基底细胞即为干细胞。酸性角蛋白表达则说明细胞处于增殖早期且具有高的增殖力。

　　6.3  抗增殖细胞核抗原单克隆抗体（PCNA）染色

　　增殖细胞核抗原可作为评价细胞增殖状态指标之一。PCNA是一种周期蛋白，在细胞周期中于S期达最大量，在正常组织中，PCNA阳性细胞仅局限于有增殖能力的区域。采用Anti-PCNA单克隆抗体对培养细胞进行染色，若有大量细胞阳性，证明此时大部分细胞具有增殖能力。

　　6.4  4G10.3染色

　　4G10.3在角膜缘基底细胞反应阳性，基底层上细胞及角膜、结膜均为阴性，说明角膜缘基底细胞含有角膜上皮的干细胞。现认为50KD蛋白和4G10.3抗体为角膜缘基底细胞提供了一种生化免疫学标志。4G10.3阳性说明培养细胞中含有大量较原始细胞，有强的增殖分化潜力。

　　7  临床应用研究
    　　
　　随着培养的人表皮和口腔上皮的成功应用，人们想到体外培养人角膜上皮细胞用于移植。Gipson等［15］进行尝试，并在动物实验方面取得一定的进展。Kristina等［16］在实验中，取1mm×1mm人角膜缘标本，培养得到角膜上皮细胞后移植到裸鼠皮下，4天后形成5～６层角膜上皮细胞，并牢固地粘附于植床上。用免疫组化的方法在基底膜部位检测出正常人角膜上皮基底所具有的胶原蛋白Ⅳ和Ⅶ型及层粘连蛋白。表明移植后的角膜缘干细胞不仅可以存活，而且能保持上皮的属性及功能。Koizumi等［17］用去除上皮的人羊膜为载体进行角膜缘干细胞体外培养，并移植到2例Stevens-Johnson综合征导致的干细胞完全缺如者，术后视力达1.0，随访6m，眼表上皮稳定，没有出现缺损。

　　Schwab等［18］对14例常规药物及手术治疗无效的眼表严重损伤者，将体外培养、扩增的角膜缘干细胞移植至患眼，随访13个月，全部术眼的症状消失，角膜重建上皮层，视力维持或有提高。Tsai等［19］对6例角膜缘干细胞缺乏者进行自体角膜缘干细胞培养后移植，术后2～4天角膜表面完全上皮化，1个月后眼表为角膜上皮覆盖，角膜透明性提高。国内潘志强等［14］利用培养的同种异体角膜缘干细胞移植治疗角膜缘功能障碍，也取得较好效果。
    　　
　　角膜缘干细胞不仅可以分化、增殖为角膜上皮细胞，更重要的是干细胞像一道屏障，阻止结膜上皮移行至角膜表面，这对保持角膜的透明性与正常生理功能有重要意义。原则上所有因角膜缘部受损、功能不良或基质不良等原因所引起的持续性上皮糜烂、新生血管侵入、假性胬肉形成等疾病，均可应用角膜缘干细胞移植术来重建眼表面。如眼部化学伤、热烧伤、Stevens-Johnson综合征、边缘性角膜炎或角膜溃疡等。

　　8  结语
    　　
　　角膜缘干细胞移植术是一种有效的重建角膜表面的方法。虽然干细胞的生物学特性、鉴别方法、体外培养体系、移植技术及移植后上皮细胞在植床上的增殖、分化、粘附等问题仍有待进一步研究，但随着研究的进展和技术的进步，角膜缘干细胞体外培养后移植治疗眼表疾病越来越表现出巨大的潜力，并将为更多的眼表疾病患者带来光明。

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