作者：唐红
作者单位：(710032）中国陕西省西安市，第四军医大学附属西京医院眼科；（710054）中国陕西省西安市，武警陕西总队医院眼科
【摘要】 目的：通过检测葡萄膜炎患者外周血中CD4+CD25high调节性T细胞的表达水平，初步探讨其在葡萄膜炎发病中的作用。
方法：取16例正常健康对照及30例不同类型活动期葡萄膜炎患者，采取抗凝外周血，进行三色免疫荧光染色、流式分析。
结果：葡萄膜炎患者外周血中CD4+CD25high T细胞的百分率与正常健康对照（8.56%±4.22% vs 5.72%±3.11％）相比，显著升高(P=0.022)，而且与患者病情严重程度明显相关（P=0.007）。另外CD4+CD25highCTLA4+T细胞在葡萄膜炎患者外周血中比例较正常对照明显升高（P=0.012）。
结论：葡萄膜炎患者外周血中CD4+CD25high Treg细胞的异常表达可能参与疾病的发生发展，并与疾病的活动密切相关。
【关键词】 葡萄膜炎 CD4+CD25high调节性T细胞 CTLA4
0引言
CD4+CD25+ 调节性T细胞（CD4+CD25+ regulatory T cells,CD4+CD25+ Treg细胞）细胞是一群具有免疫抑制功能的T细胞。体内外实验均证实，该细胞具有抑制自身反应性T、B细胞的活化、增殖，免疫球蛋白分泌以及各种炎性细胞因子产生的作用。而越来越多的研究表明，CD4+CD25+ Treg细胞在自身免疫性疾病中发挥着重要的作用[1]。CD4+CD25+ T细胞又可分为CD4+CD25high T细胞和CD4+CD25low T细胞，在小鼠中，二类细胞都有免疫活性，而有人认为在人类外周血中起免疫抑制活性的是前者[2]。葡萄膜炎（uveitis）作为一组累及葡萄膜、视网膜、视网膜血管及玻璃体的器官特异性自身免疫病[3]，迄今为止发病机制还尚不明确。近年来，发现在实验性自身免疫性葡萄膜视网膜炎(experimental autoimmune uveoretinitis，EAU)中CD4+CD25+ 调节性T细胞起到重要作用[4]，而Treg细胞在葡萄膜炎患者中的表达及作用少有报道。因此，本实验拟通过检测不同病情程度葡萄膜炎患者外周血中CD4+CD25+ Treg细胞的表达水平，来探讨Treg细胞在葡萄膜炎发病过程中的作用，从而为今后进一步选择恰当的治疗葡萄膜炎的方法提供实验依据。
1材料和方法
1.1材料 PerCP标记的antiCD4单抗、APC标记的antiCD25单抗、PE标记的antiCTLA4 mAb (均购自美国BD Pharmingen公司)，红细胞裂解液(美国BD公司)，流式细胞仪（FACS calibur，美国BD公司）。
1.2方法 选取活动期葡萄膜炎患者30例，全部病例均为20050901/20060330于第四军医大学西京医院医院眼科就诊的患者。其中男18例，女12例，年龄17～71(平均35.3)岁。所有患者均依据国际葡萄膜炎研究组的病因学分类标准进行诊断。其中全葡萄膜炎患者为9例，前葡萄膜炎患者8例，中后葡萄膜炎患者5例，后葡萄膜炎患者8例。正常对照为16例体检正常者，男10例，女8例，年龄20～55(平均34.2)岁。所有患者均按照以下疾病严重程度评分标准进行评分[5]：睫状充血（1分），房水细胞或房闪阳性（1分），角膜后沉着物（1分），虹膜粘连（1分），玻璃体有细胞或者视网膜病变（1分），计算总分。其中7例患者评分5分，6例为4分，4例为3分，7例为2分，6例为1分。免疫荧光染色流式分析：取正常对照或者患者抗凝外周静脉血2mL，取其中100μL，加入抗体FITC标记的antiCD4单抗，APC标记的antiCD25单抗及PE标记的antiCTLA4单抗各10μL，，阴性对照组加入荧光标志的相对应的同型抗体。室温避光反应30min，然后加入红细胞裂解液2mL，室温避光反应10min。1000rps/min离心10min后弃上清，用PBS重悬细胞，离心洗涤两遍后，用300μL PBS重悬细胞，上流式细胞仪检测，选取细胞总数为20000个，结果用cellquest软件分析。
统计学处理：实验结果用SPSS for Windows软件分析,CD4+CD25high细胞及CD4+CD25highCTLA4+细胞在CD4+中表达用Students t检验，CD4+CD25high比例与患者病情严重程度的相关分析用spearman相关分析，均以P<0.05为差异显著性判定标准。
2结果
2.1 CD4+CD25high在CD4+中表达的比例 正常人及葡萄膜炎患者外周血中均能测到CD4+CD25highT细胞,CD4+CD25highT细胞所占的比例以其在CD4+T细胞中所占的百分比计算。各选取一例代表性的对照及患者流式结果图（图1）显示：葡萄膜炎患者外周血CD4+CD25highT比例较健康对照高。而统计分析显示, 处于病情活动的葡萄膜炎患者外周血中CD4+CD25high T细胞的百分率为8.56%±4.22%（n＝30）, 与正常健康对照（5.72±3.11％，n＝16）相比，显著升高(P=0.022，图2)。
2.2 CD4+CD25high比例与患者病情的相关分析 对30例活动期的葡萄膜炎患者CD4+CD25high T细胞比例与病情严重程度及血沉指标进行相关分析。依据前面所提的评分标准将病情严重程度进行评分。sprearman相关分析结果显示：葡萄膜炎患者CD4+CD25high T细胞比例与患者病情严重程度明显相关（图3，R=0.487,P=0.007），而与患者的血沉水平无明显相关性(P>0.05)。
2.3 CD4+CD25high表达与不同葡萄膜炎类型分析 在我们选取的患者中，全葡萄膜炎患者为9例，前葡萄膜炎患者8例，中后及后葡萄膜炎患者共13例。CD4+CD25high在外周血CD4+细胞中表达显示：全葡萄膜炎患者为9.60%±3.93%，后及中后葡萄膜炎为8.11%±3.96%，前葡萄膜炎患者表达为 9.33%±5.01%，与所有外周血CD4+CD25high表达（8.56%±4.22%）相比，无显著性差异（P>0.05），三者之间也无显著性差异（P>0.05）。
2.4 CD4+CD25highCTLA4+在CD4+中表达的比例 我们采用三色免疫荧光染色分析，研究了CD4+CD25highCTLA4+T细胞的表达比例。结果发现，正常人及葡萄膜炎患者外周血中均能测到CD4+CD25highCTLA4+T细胞,正常健康对照外周血中比例较低，为3.05%±1.90%，相比而言，葡萄膜炎患者外周血中比例升高，为4.97%±3.06%，两者相比有显著统计学差异（P＝0.012）。
图1 CD4+CD25high细胞在CD4+T细胞中表达流式图（R1: CD4+CD25highT 细胞 A: 1例正常健康对照，B：1例葡萄膜炎患者）（略）
图2 对照及葡萄膜炎患者CD4+CD25high T细胞的比例(control:正常健康对照；uveitis patients：葡萄膜炎患者)（略）
图3 葡萄膜炎患者CD4+CD25high T细胞比例与患者病情严重程度的相关分析（略）
图 4 CD4+CD25highCTLA4+在CD4+中表达的比例(control:正常健康对照；uveitis patients：葡萄膜炎患者)（略）
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