作者：李威东,徐国兴,郑绍斌,郭健
作者单位：(350005)中国福建省福州市，福建医科大学附属第一医院 福建省眼科研究所
【摘要】 目的:探讨兔角膜上皮厚度在A型超声下与共焦下测量结果的相关性，及表面麻醉药对角膜上皮的作用。方法:将20只兔随机分为两组，分析左右眼之间的统计学差别；再将左眼做为参照组，右眼滴用表面麻醉药，分析表面麻醉药对角膜上皮的影响；最后将参照组用同样方法处理后，将40眼的角膜上皮在A超下与共焦下的测量值进行统计学分析。结果：兔眼别与角膜中央厚度的测量没有显著差别；倍诺喜表面麻醉液会使角膜上皮厚度增加； A型超声下与生物共聚焦显微镜下测量的角膜上皮厚度呈正相关。结论：倍诺喜可使角膜上皮松解；A超下测量角膜上皮越厚，其共焦下测量角膜上皮也越厚。
【关键词】 兔 角膜上皮厚度 A型超声 共焦显微镜
0引言
活体角膜中央厚度（central corneal thickness,CCT）的测量方法有A型超声波角膜测厚仪、UBM、光学裂隙灯测厚仪、眼前节光学相干断层扫描、Orbscan裂隙扫描角膜地形图/角膜测厚系统及共焦显微镜等,其中超声角膜测量法是较为准确的测量方法。我们用超声测量法测量CCT。测量死后角膜厚度的方法目前报道很少。活体角膜通过普通切片来测量将会产生很大的误差,因为在制片过程中的脱水会造成角膜的皱缩，从而影响角膜测量的准确性。我们对兔活体与死体角膜上皮之间关系相关及表面麻醉药物对角膜上皮影响研究如下。
1材料和方法
1.1材料
四川大学医学实验动物中心提供健康新西兰大耳白兔20 只，兔龄3～4mo，体质量1.9～2.2kg,雌雄兼用；经裂隙灯检查均无眼前节病变。A型超声角膜测厚仪。美国思博明科学器材公司，在图像分析系统下进行角膜厚度测量。应用图像分析系统本身载物台标本移动距离测量角膜上皮厚度。4g/L倍诺喜滴眼液（日本参天制药株式会社）。
1.2方法
耳缘静脉注射水合氯醛后，采用随机数字表法随机取实验动物1眼作为实验组,另1眼作为对照组。再对20只兔采用区组随机法,分成2组,每组10只。A型超声角膜测厚仪测量中央角膜厚度各3次取平均值。用显微镊于兔的角膜中央固定区取直径约6mm的角膜上皮,然后马上测量去上皮角膜厚度，同时角膜上皮沿中央剪开标本固定于40g/L中性甲醛中4h,常规脱水、竖立石蜡包埋, 5μm厚连续切片,常规HE染色，直接用图像分析系统进行角膜上皮厚度测量。图像分析系统对HE染色标本进行角膜上皮测厚。上皮厚度的计算方法是取切削区中点、边界点以及两点之间的中心点,共5个点,上端起于上皮表面,下端止于基底膜上,平均值即为上皮厚度。水合氯醛自兔耳缘静脉注入，待兔进入全麻状态后，乙醇消毒铺巾，用复方乳酸林格液做溶剂的80g/L妥布霉素溶液冲洗结膜囊。测量角膜厚度统一用A超，在点一滴表面麻醉药（4g/L倍诺喜）60s后进行，测3次结果取平均值。将新鲜配制的200mL/L的乙醇溶液(997mL/L的无水乙醇1mL中加入注射用蒸馏水4.0mL)0.15mL置于上皮环钻内，开始计时25s后，吸血海绵吸干乙醇，BSS立即充分冲洗，避免损伤上皮。取下的角膜上皮片在4℃下，30g/L甲醛溶液中固定4h，0.1mol/L磷酸缓冲液中漂洗1h(换液3次)。再逐级脱水。角膜上皮及角膜平铺，竖立包埋角膜上皮及角膜后，纵向切片。HE染色，共聚焦显微镜下测量角膜上皮厚度。
统计学分析:所有数据均使用SPSS 11.5统计处理软件包。组之间进行统计学分析比较，组内各小组之间进行统计学分析比较，数据以均数±标准差表示，采用方差分析中Dunnettt检验。P<0.05时差异有统计学意义。
2结果
未麻醉时左右眼A超的角膜厚度值没有统计学差异(358±17μm vs 350±13μm,P=0.128)。表面麻醉药对角膜上皮厚度有一定影响（355±18μm vs 351±16μm，r=0.473，P＝0.035），说明表面麻醉液可能会使角膜上皮厚度增加。A超下角膜上皮厚度为25.00±5.50μm，而在生物共聚焦显微镜为16.56±6.93μm，说明二者高度相关；即A超下的角膜上皮越厚，共焦下的角膜上皮越厚（相关系数r=0.593，P<0.01）。
3讨论
渗透压对于维持角膜处于一个脱水状态是一个不可缺少的因素[1]。活体角膜之所以能够始终保持透明和相对脱水状态,是通过角膜内皮细胞的主动的代谢性液泵作用和把房水与角膜基质隔开的机械性屏障作用来实现的。人体或动物死亡后角膜内皮进入到基质,使得基质层肿胀,而基质层占角膜厚度的90%,故而使角膜增厚,透明度下降；活体的角膜厚度的测量方法有很多种,如A型超声波角膜测厚仪、UBM、光学裂隙灯测厚仪、眼前节光学相干断层扫描、Orbscan裂隙扫描角膜地形图/角膜测厚系统及共焦显微镜等。其中超声波角膜测量法是公认较为准确的测量方法[2,3]。我们用超声测量法测量CCT。这些方法现多用于临床测量,而测量死后角膜厚度的方法目前报道很少。活体角膜通过普通切片来测量将会产生很大的误差,因为在制片过程中的脱水会造成角膜的皱缩，从而影响角膜测量的准确性。左右眼角膜厚度没有统计学差异，说明在该研究中眼别的影响不大。这与多数学者研究报道相似。现多数研究报道CCT与性别，年龄无显著性意义[38]。故我们就不对CCT与性别、年龄之间关系进行研究，直接对成年雌雄兔研究。倍诺喜表面麻醉药对角膜上皮的厚度有一定影响，也有可能促使角膜上皮的松解起到一定的作用。A超下兔的角膜上皮厚度与角膜厚度呈正相关，角膜越厚，角膜上皮就越厚。
共焦显微镜下兔的角膜上皮厚度与A超下角膜上皮厚度呈正相关，即A超下测量角膜上皮越厚，其共焦下测量角膜上皮也越厚。为以后进一步研究角膜上皮与角膜厚度之间的关系提供相关依据。尽管我们发现角膜上皮随角膜厚度而变化,且相关性强,较真实地反映实际情况。但本研究是动物实验,动物与人存在种属差异,且本研究采用的均是健康家兔,死因一致,同时还控制了温度和湿度等实验条件。这样,和日常人所处的环境条件,个体差异,健康状况,手术条件等均影响相似。因此,必须了解各种影响因素对其作用规律,才能使角膜厚度与角膜上皮的相关性研究更加合理，准确，为以后更广泛进一步地应用于临床实践提供依据。
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