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3.2 PCR技术的敏感性 Vodkin等[7]能利用PCR从单个滋养体中扩增出相应的基因产物。我们将提取的40μL DNA样品分4管，全部参加PCR反应，保证平均1～2个滋养体可获得ASA.S1产物，这个敏感性已经在16个病例中被证实，包括部分刮片、培养为阴性的病例(表2)。我们明确知道细胞克隆能从单个胞囊和滋养体中获得，同样我们已经知道单个滋养体足够PCR反应。但以我们目前的技术和知识水平尚未在成熟的棘阿米巴胞囊中获得基因扩增产物。A3a，A9a培养和刮片阴性的病例中PCR结果阳性，而A3b，A9b，A12，A15均为治疗过的，培养阳性，PCR结果阴性，推测经治疗后棘阿米巴可能因环境变化，形成成熟的胞囊，目前的实验结果表明PCR成功的关键是样本中含有滋养体和未成熟的胞囊，而培养阳性PCR阴性的样本中只含有成熟的胞囊。来就诊病例最短1wk，角膜刮片镜检结果只有5例明确诊断为阳性。分析原因可能由于这时角膜上皮损害较小，刮片部位太浅，未刮到原虫有关[10]。另外当混合真菌感染时，100g/L KOH并不能破坏真菌的孢子，再加上对棘阿米巴形态认识不够，很容易漏诊。而PCR技术则可以完全排除主观因素，早期明确诊断。
3.3 PCR技术其他优点 由于PCR 的种属诊断特异性、JDP1JDP2引物扩增的敏感性强，所以只需极少量标本，就可获得阳性结果。Hot start体系减少了多次加样的麻烦，对于多样本操作时减少了错误出现。加上目前采用电脑调控的DNA 扩增仪，只需一次性把整个反应系统配置好，输入正确程序，便可自动进行变性、复性、延伸3个反应阶段，产生正确的PCR产物。所以整个操作非常简便、迅速。为临床快速诊断提供了有效手段[11]。
【参考文献】
1 Dgkou I, Lom J, SchroederDiedrich JM, et al. Acanthamoeba strains isolated from organs of freshwater fishes. J Parasitol 1999;85(6):11061113
2 Howe DK, Vodkin MH, Novak RJ, et al. Identification of two genetic markers that distinguish pathogenic and nonpathogenic strains of Acanthamoeba. Parasitol Res 1997;83(4):345348
3 Lehmann OJ, Green SM, Morlet N, et al. Polymerase chain reaction analysis of corneal epithelial and tear samples in the diagnosis of Acanthamoeba keratitis. Invest Ophthalmol Vis Sci 1998;39(7):12611265
4 Stothard DR,Schroederdiedrich JM,Awward MH, et al. The evolutionary history of the genus acanthamoeba and the identification of eight new 18s rRNA gene sequence types. J Eakaryot Microbiol 1998;45(1)：4554
5 Bayers TJ, Hngo ER, Stewart VJ. Genes of acanthamoeba DNA, RNA and protein sequences：a review. J Protozool 1990;37(4)：1722
6 Booton GC, Kelly DJ, Chu YW, et al. 18S ribosomal DNA typing and tracking of Acanthamoeba species isolates from corneal scrape specimens, contact lenses, lens cases, and home water supplies of Acanthamoeba keratitis patients in Hong Kong. J Clin Microbiol 2002;40(5):16211625
7 Vodkin MH, Howe DK, Visvesvara GS, et al. Identification of Acanthamoeba at the generic and specific levels using the polymerase chain reaction. J Protozool 1992;39(3):378385
8 Mathers WD, Nelson SE, Lane JL, et al. Confirmation of confocal microscopy diagnosis of Acanthamoeba keratitis using polymerase chain reaction analysis. Arch Ophthalmol 2000;118(2):178183
9 Schroeder JM, Booton GC , Hay J, et al. Use of subgenic 18S ribosomal DNA PCR and sequencing for genus and genotype identification of Acanthamoebae from humans with keratitis and from sewage sludge. J Clin Microbiol 2001;39(5):19031911
10邓新国，孙秉基,庞广仁.棘阿米巴角膜炎的实验室诊断及实验研究.河南医学研究 2000;9(1);1013
11靳雷,井上美智子.聚合酶链反应技术对棘阿米巴角膜炎诊断的临床应用.临床眼科杂志 2003;11(2): 124125
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