【摘要】 动态观察视神经损伤后视网膜中P38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）活性的表达变化和早期细胞凋亡情况。方法：制作大鼠视神经钳夹伤模型后设立对照组、假手术组和视神经夹伤组，应用免疫组化方法及流式细胞仪分别检测视神经损伤后1,6,12,24h;15,30d共6个时间点3组大鼠视网膜中磷酸化（活化）P38MAPK的表达和早期细胞凋亡率，同时对视网膜形态学改变进行观察。结果：视神经损伤诱导视网膜神经节细胞（RGC）严重丧失，损伤后1～15d RGC快速减少，15d后缓慢减少。在正常对照组、假手术组磷酸化P38MAPK表达阴性，视神经损伤后P38MAPK活性的表达于6h检测到表达，逐渐增加至24h阳性表达达高峰，15d表达下降，30d消失，具有统计学意义（P<0.01）。视神经损伤后早期细胞凋亡率逐渐上升，24h达最高8.9%，随后下降。结论：视神经不完全损伤刺激了大鼠视网膜中P38MAPK的活性表达，与早期细胞凋亡率变化相似。P38MAPK通路与视神经损伤诱导的大鼠视网膜RGC凋亡密切相关。
【关键词】 P38丝裂原活化蛋白激酶 视神经损 视网膜神经节细胞 细胞凋亡
视神经损伤可以由高眼压、机械性损伤、肿瘤压迫等多种原因引起，临床上缺乏有效的治疗方法，因此视神经损伤后，细胞通讯及信号转导变化成为目前基础研究的热点[1]。研究表明视神经损伤后视网膜神经节细胞发生明显的细胞凋亡现象，其过程存在着多种途径及机制[2]。近年来文献报道丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族中的P38MAPK参与多种中枢神经细胞的细胞凋亡调节过程[3-5]。为探讨视神经损伤后视网膜神经元，特别是神经节细胞内P38MAPK的活性是否表达及其与细胞凋亡的关系，我们采用大鼠视神经夹伤模型，对视神经损伤后大鼠视网膜内P38MAPK活性表达的变化及早期细胞凋亡的情况进行了动态观察。
1材料和方法
1.1材料
健康Wistar大鼠68只，2～3mo龄，质量200～250g，均为雄性。购自内蒙古大学实验动物中心，清洁级。自由饮食，在光/暗周期为12h/12h，背景噪音40±10dB条件下限制饲养。常规外眼及眼底检查均正常。将实验动物随机分为正常对照组、假手术组和视神经夹伤组，正常对照组为8只，另2组共用60只，每只随机选取单眼完成视神经夹伤模型，对侧眼作为假手术组，完成损伤后60只大鼠再按伤后存活时间随机分入1，6，12h;1，15，30d共6个时间点，每个时间点10只。
1.2方法
首先建立大鼠视神经夹伤模型。腹腔注射氯胺酮50mg/kg完成麻醉后，将大鼠俯卧固定于手术台上，双眼局部滴地卡因表面麻醉，常规消毒手术眼，于双目显微镜下切开外眦，打开Tenon囊，分离外直肌并剪断，沿颞侧巩膜表面钝性分离充分暴露视神经[6,7]，用小号动脉阻血镊在眼球后2mm处夹持视神经30s造成视神经夹伤[8]。取下小号动脉阻血镊后复位眼球，缝合Tenon囊及外眦皮肤伤口，局部涂抗生素眼膏。操作中注意避免损伤后极部血管。假手术组只暴露出视神经，不做视神经夹伤。手术后在显微镜下用盖玻片轻压角膜，观察视网膜血供良好者纳入实验。分别于术后6个时间点处死动物，立即摘除眼球，尽可能包括较长的眶内段视神经。剥离眼球周围的软组织和视神经周围筋膜，在眼球的后房处用注射器注入适量固定液，然后将完整眼球放入40g/L多聚甲醛液中固定48h，流水冲洗，酒精梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，转轮式切片机切成5μm厚度切片，HE常规染色，中性树胶封片，光学显微镜下观察摄片。
1.2.1视网膜组织中P38MAPK活性表达的检测
磷酸化P38MAPK小鼠单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，浓缩型SP系列检测试剂盒购自北京中山生物技术有限公司。采用标准的SP免疫组织化学检测方法，并以PBS缓冲液代替一抗，设立相应的阴性对照片。分别取6个时间点的各组及正常对照组的石蜡切片，置60℃温箱15min取出室温冷却，常规梯度脱蜡水化，0.01mol/L PBS冲洗3次×5min；按照SP免疫组化试剂盒操作方法完成标本染色，其中一抗稀释度为1∶100，抗原修复使用胰蛋白酶消化法，浓度为0.05nkat/L。在高倍显微镜下随机选取5个视野观察免疫组化染色结果，染色强度的测定是采用JD801形态学图像分析系统完成，取平均灰度值代表每组视网膜中染色强度的相对值。
1.2.2流式细胞仪动态检测细胞凋亡率
摘除眼球后，在垫有冰块的玻璃平皿中迅速去除眼前节组织，手术显微镜下仔细剥离视网膜置于4℃预冷的生理盐水中。将处理好的视网膜研磨碎后用300目铜网过滤，收集细胞悬液放入高速冷冻离心机中以750r/min离心5min，倒掉上清，0.01mol/L PBS冲洗，分别取500μL细胞悬液加入胃蛋白酶消化，37℃条件下消化5min，再次离心5min，弃去上清，每管中加入Binding Buffer 500μL后分出4管，分别设为正常对照组、AV染色标记组、PI染色标记组和AV+PI双染色标记组。上流式细胞仪检测视网膜细胞的早期凋亡。
统计学处理：全部数据应用SPSS10.0统计软件进行统计分析，对各组实验数据求均数及标准差。多组比较用单因素方差分析，两两比较用t检验。取α=0.05作为检验水准，P<0.05有显著性差异。
2结果
2.1视网膜光镜观察
正常对照组视网膜各层结构清晰，完整。RGC呈密集单层排列，胞核大小不一，核内染色质分布均匀，部分细胞核内可见清晰的核仁（图1A）。假手术组视网膜结构无任何变化，与正常对照组结果一致（图1B）。视神经损伤后1～12h，视网膜病理改变不明显。1和6h可见视网膜RGC部分细胞轻度水肿，结构欠清楚。12h有个别节细胞出现核固缩，空泡形成（图1C）。24h后RGC胞核数量出现减少，内丛状层（IPL）、内核层（INL）变薄（图1D）。伤后15d视网膜神经节细胞层（GCL）胞核明显稀疏，RGC数目明显减少，神经纤维层明显变薄、萎缩，外核层（ONL）变化不明显（图1E）。30d后全视网膜厚度明显变薄，RGC较15d时进一步减少，INL和ONL细胞也见减少（图1F）。
2.2视神经光镜观察结果
正常大鼠视神经纤维由隔膜分成束状，髓鞘形态呈圆形、椭圆形和不规则型，中央区髓鞘密集结构完整，靠近周边则相对稀疏（图2A）。假手术组视神经结构清晰，没有病理改变。视神经损伤组视神经均有程度不同的病理改变，损伤后24h出现较明显的髓鞘结构消失，空泡变性，间质水肿改变（图2B）。15d神经纤维束结构已不规则，部分消失，局部坏死组织崩解成碎片堆积。30d多数髓鞘、轴突变性、消失，视神经内部可见胶质细胞增生。
2.3视网膜中P38MAPK的活性表达变化
具有活性的磷酸化P38MAPK在正常对照组和假手术组的各时间点视网膜中均未见表达，视神经夹伤6h后视网膜内出现磷酸化P38MAPK的表达，阳性信号主要位于神经节细胞层和内丛状层，胞质及胞膜表达明显。12h后神经节细胞层表达增强，胞质与胞核均匀染色，内核层也出现表达。24h活性表达达到峰值，神经节细胞内细胞质染色强度减弱，而细胞核染色明显增强呈现深褐色。15d明显下降，30d活性消失，表达阴性（图3，4）。经统计分析视神经损伤组6，12，24h时间点的活性表达与正常对照组比较差异有显著性意义，6，12，24h;15d的活性表达与假手术组相比较差异有显著性意义（表1）。表1视网膜组织P38MAPK强度（略）
2.4细胞凋亡检测结果
正常对照组早期细胞凋亡率为0.53%（图5A），假手术组检测到的细胞凋亡所占百分率为1.04%（图5B），两者比较差异无显著性意义。视神经损伤后细胞凋亡率随时间推移不断升高，24h达最高峰为8.9%（图5C），然后下降至30d后为1.79%（图5D，4B）。变化曲线见图15。视神经损伤后1，6，12，24h的细胞凋亡率与正常组比较差异有显著性意义，15，30d时间点的细胞凋亡率与正常组比较差异无显著性意义。
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