【摘要】 目的:探讨组织工程角膜上皮移植治疗角膜碱烧伤的疗效和时机。 方法:1mol/L NaOH制作改良兔角膜碱烧伤模型21只42眼,分对照组和移植组，移植组分别在碱烧伤后1,3,6,9d（早）和14d（中）行自体或同种异体组织工程角膜上皮移植术,比较移植组及对照组烧伤后28d内眼表和组织病理学变化。结果:角膜碱烧伤后7d开始出现角膜上皮的大片脱落，14d角膜上皮大片脱落或溃疡发生率达72%，持续至28d，而移植组在28d时发生率仅为25%，大多获得完整的角膜上皮；烧伤后早期移植组角膜基质深层炎性细胞浸润和新生血管生长较对照组明显受到抑制，而中期移植组角膜基质层较对照组并无明显差异；28d内异体组织工程角膜上皮移植的免疫排斥反应并不大于自体移植。结论:自体或同种异体组织工程角膜上皮移植均可尽快恢复眼表完整性，且烧伤后早期移植效果明显优于中期移植。
【关键词】 角膜碱烧伤；组织工程角膜上皮；移植
Morphology observation of treating corneal alkaline burn by in vitro tissue engineering corneal epithelium transplantation
YuLi Pi1, JiangYang Lu2, WeiQiang Tang1, Ying Dong1
1Department of Ophthalmology, the First Affiliated Hospital of PLA Genenal Hospital, Beijing 100037, China; 2Department of Pathology, the First Affiliated Hospital of PLA Genenal Hospital, Beijing 100037, China
AbstractAIM: To probe the effect and opportunity of treating corneal alkaline burn by in vitro tissue engineering corneal epithelium transplantation.
METHODS: Reforming corneal alkaline burn models of double eyes of 21 rabbits were induced in vivo by 1N NaOH, then, divided into control group and transplantation group. In vitro autologous or allogenic tissue engineering corneal epithelium transplantation was conducted on early time points (1, 3, 6, and 9 days) or metaphase (14 days) after alkaline burning. The ocular surface integrity and histopathology were observed on several time points within 4 weeks.
RESULTS: One week after corneal alkaline burning, large corneal epithelial desquamation occurred. 72% of epithelial desquamation or corneal ulcer was found on the second week, and keeping on to 4 weeks, while only 25% were observed in transplantation group, most gained ocular surface integrity. Cell infiltration and vascularization of corneal stroma had not been suppressed in metaphase transplantation group, while they were suppressed obviously in the deep corneal stroma in early transplantation groups. Within 4 weeks, immunological rejection induced by allogenic transplantation was not exceed that of autologous transplantation.
CONCLUSION: Cultivated autologous or allogenic tissue engineering corneal epithelium transplantation can both recovery ocular surface integrity as soon as possible, and the effect of early transplantation is surpass that of metaphase.
KEYWORDS: corneal alkaline burn; tissue engineering corneal epithelium; transplantation
Pi YL, Lu JY, Tang WQ, et al. Morphology observation of treating corneal alkaline burn by in vitro tissue engineering corneal epithelium transplantation. Int J Ophthalmol(Guoji Yanke Zazhi)2008;8(11):22102213
0引言
角膜碱烧伤过程涉及复杂的炎症和免疫反应，角膜缘干细胞可由于碱烧伤的严重程度不同而受损甚至丧失,从而导致角膜混浊、炎症、血管化和严重不适[1]。采用健康角膜缘干细胞体外培养形成组织工程化角膜上皮，移植于碱烧伤后角膜创面可促进创面的修复愈合，我们观察了角膜碱烧伤后不同时间点，自体或同种异体组织工程化角膜上皮移植对碱烧伤兔眼表形态学和病理学改变的影响如下。
1材料和方法
1.1 材料 速眠新Ⅱ0.1mL/kg+氯胺酮0.1mL im麻醉后，对兔双眼采用1mol/L NaOH的氢氧化钠制作改良角膜碱烧伤模型,直径10mm滤纸片从上方角膜缘开始均匀置于角膜表面，使滤纸均匀贴附90s，随即用30mL生理盐水持续缓速冲洗，取兔上方健康角膜缘组织1mm×1mm，用磷酸基缓冲液冲洗3次，0.5g/L胰酶消化10min，加100g/L DMEM血清培养基中和消化后，取出组织块离心，将组织块和细胞共同培养在直径35cm的培养皿中，加角膜生长培养液0.5mL，其中含有Epilife培养液（美国Cascade Biologics公司）和角膜生长的添加剂，每3d换液1次。将5000～20000个培养的角膜上皮细胞，与通过血浆离心得到的300μL,纤维蛋白原和凝血因子成份（在4℃条件下，将血浆以3500r/min速度离心30min）混合于培养皿上，37℃ 45min后形成组织工程角膜上皮，在8h内应用临床移植。新西兰大白兔21只,体质量2.0～2.5kg,雌性，由解放军总医院第一附属医院实验动物中心提供,随机分为对照组8只16眼，移植组（早期，1d移植组2只4眼、3d移植组3只6眼、6d移植组3只6眼、9d移植组2只4眼）和14d移植组（中期）3只6眼，分别在烧伤后相应时间对双眼角膜创面进行组织工程化角膜上皮移植术。
1.2方法 兔麻醉后沿角膜缘剪开全周球结膜，后退2mm，角膜表面彻底清创，取相应大小的组织工程角膜上皮植片缝合在浅层巩膜上，涂抗生素眼膏；3d移植组和14d移植组各2只4眼为自体组织工程角膜上皮移植，其余均为异体移植，自体移植眼烧伤前角膜缘干细胞培养取材位置与烧伤滤片贴附角膜缘位置一致。采用olympus SP350型数码相机拍照，碱烧伤模型制作后28d时间点，比较各移植组眼表形态变化，对照组分别在角膜碱烧伤后3,7,14,21d过量麻醉处死1只兔2眼，28d处死其余兔。眼球置40g/L多聚甲醛固定液中固定15～20min后，取完整角膜继续固定2h左右，剪除烧伤斑角膜缘侧约5～6mm角膜组织（烧伤斑直径10mm），依次梯度酒精脱水、二甲苯透明，石蜡立埋， 5μm连续切片，苏木素液染色，制片。
2结果
2.1眼表形态变化 烧伤后即刻见角膜创面出现半透明的圆斑，透过圆斑隐约可见虹膜，随着生理盐水30mL持续冲洗，烧伤角膜逐渐水肿、不透明，烧伤圆斑最终呈瓷白色（图1A）；烧伤后7d，对照组14眼烧伤角膜中6眼出现角膜上皮大片脱落，占43%（图1B）；14d，对照组12眼和14d移植组6眼共18眼中，13眼（72%）发生角膜上皮大片缺损或溃疡，烧伤后14～28d，对照组2眼和3d移植组1眼出现角膜穿孔（图1C）；28d，对照组8眼有6眼（75%）角膜上皮不同程度缺损脱落。对照组烧伤后3～4d开始出现角膜缘新生血管、毛刷样外观，7d时除上方烧伤圆斑顶端，其余圆周均有CNV生长、长度达3～4mm（图1D），14d时CNV生长达到高峰，甚至烧伤斑远端新生血管可达到其边缘、两侧新生血管生长入烧伤斑中心（图1E），21d以后CNV呈现逐渐消退、稀疏的趋势，以烧伤斑远端消退明显（图1F）。移植组28d时，26眼中20眼（75%）角膜上皮光滑、完整;3d和14d移植组分别1眼自体移植角膜发生穿孔和溃疡;6,9d移植组各1眼;14d移植组2眼异体移植角膜上皮发生大片脱落（合计25%），3d移植组1眼从术后即刻至烧伤后28d角膜上皮始终完整（图2A～F）。
2.2组织病理学变化 对照组烧伤后3d，角膜全层组织结构紊乱、部分角膜上皮修复增生，局部上皮组织由多层细胞组成，浅基质层胶原纤维疏松、粘液变性，基质层大量炎性细胞浸润（图3A）；烧伤后7d，角膜修复上皮厚薄不均，从２～３层细胞，至４～５层细胞不等，基质浅层角膜坏死区域大量急慢性炎细胞浸润（图3B）；烧伤后14d，角膜修复上皮有４～５层细胞，浅基质层成纤维细胞增生，基质层炎症细胞浸润和新生血管增生达高峰（图3C）；14～28d大部分修复的上皮再次脱落，再生的上皮厚薄不均，上皮形状不规则、可形成向基质层生长的上皮突，基质层胶原纤维大量增生、排列紊乱，全基质层大量炎性细胞浸润（图3D），部分角膜形成溃疡，溃疡边缘及底部积聚大量炎症细胞，穿孔的角膜组织可见大量炎性细胞浸润贯穿全层（图3E）。移植组28d角膜上皮形状不规则、向基质层生长形成上皮突，基质层胶原排列较对照组整齐、坏死组织少，但14d移植亚组角膜基质内炎细胞浸润和新生血管较对照组减少并不明显，而1、3、6、9d移植亚组角膜深基质层则较对照组明显受到抑制（图4A～C）；3d和14d自体移植与异体移植角膜未表现出差异（图4C，D）。
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