1 材料和方法

    1.1 材料 供体取自中山眼科医院，摘自死亡1h内无眼疾青年尸体眼球。眼球摘出置冰壶保存，取回后抗菌处理，湿房保存７~24h。高糖DMEM培养基（吉诺生物医药技术有限公司），新生牛血清（美国Gibco公司）， Trizol（美国Invitrogen），Real-time PCR Master Mix(日本Toyobo)，兔抗人IκBα多克隆抗体、兔抗人NF-κB p65多克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司)，磷酸化NF-κB p65多克隆抗体（美国Signal antibody technology公司）FITC标记的羊抗兔IgG(武汉博士德生物工程有限公司)，HRP羊抗兔IgG（北京博奥森生物技术有限公司），四甲基联苯胺显色试剂盒（北京赛驰生物科技有限公司），SDS(美国 Sigma公司)。

    1.2 方法 人睫状肌细胞培养方法见参考文献[6], 我们采用第4，5 代融合睫状肌细胞。用第4,5代细胞用无牛血清培养液换液，24h后，将细胞分为对照组和实验组，试验组分别加入1μmol/L曲伏前列腺素travoprost，按照加入药物后孵育细胞的时间不同，分成6，12，24h组收集细胞。

    1.2.1 Real-time RT-PCR Trizol一步法提取人睫状肌细胞总RNA，反转录得到cDNA产物，real-time RT-PCR进行cDNA产物扩增，并计算mRNA相对表达量。PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。引物序列NF-κBp65:（F:5'-accatggtgtttccttctgg-3',R:5'-acaggtatgccctggttcag-3', 359bp）；IκBα:(F:5'-cacactgcacactgcctagc-3',R:5'- accactggggtcagtcactc-3',223bp)；内参照G3PDH：（Ｆ：5'-accacagtccatgccatcac-3'Ｒ：5'-tccaccaccctgttgctgta-3'，450bp）。取模板 (10pmol/μL) 共2μL，总反应体积为25μL进行逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）。设置反应程序：95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸45s，共计40个循环，最后72℃延伸7min，产物进行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下拍照。real-time RT-PCR 反应体系含模板 2 μL，反转录产物2μL ，real-time PCR master mix15μL，总反应体积为30μL。反应条件：95℃变性15s，56℃退火15s，72℃延伸1min，共计40个循环。

    1.2.2 NF-κB p65、IκBα蛋白表达的检测 细胞爬片后用无血清培养液培养24h后，分为对照组和实验组，实验组加入1μmol/L曲伏前列腺素无血清培养液，分别于6，12，24h及加药前取玻片于丙酮固定。分别加兔抗人IκBα、NF-κB p65抗体细胞爬片上,湿盒内4℃冰箱过夜。PBS冲洗后加FITC标记羊抗兔IgG,二抗反应30min，封片。

    1.2.3磷酸化NF-κB p65蛋白的检测 将收集0, 6 ,12, 24h组细胞溶于10g/LSDS，100℃加热5min裂解。包被，洗涤。将NF-κB p65与磷酸化NF-κBp65一抗按1∶1 000稀释后，加0.1mL于已包被反应孔，同时做空白孔，37℃保温1h, 洗涤。加1∶500稀释酶标抗体（HRP-羊抗兔IgG）0.1mL。37℃保温1h，洗涤。TMB底物溶液显色。于450nm处，以空白对照孔调零后测各孔A值。

    统计学处理：结果用均值±标准差表示。单因素方差分析法分析各组间的差异是否有统计学意义。

    2结果

    两组细胞分别用Smooth muscle α-actin　和Desmin免疫荧光反应和免疫组化均阳性，证实培养的95%以上是人睫状肌细胞。

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