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3讨论
目前，相对于传统的视网膜母细胞瘤(retinoblastoma,RB)治疗方法而言，RB基因治疗不仅可以弥补光凝固治疗、光动力学治疗、温热治疗、冷冻治疗的应用局限性，而且不会产生诸如化学治疗、放射治疗的副作用，更不会因为眼球摘除所导致的致残性而造成患儿心理障碍影响生图1RTPCR产物凝胶电泳图 M:DL2000 Marker;1:转染组可见预期的CDTK(403bp)目的片段和βactin(561bp);2:未转染组;3:阴性对照。图2Western Blot检测CDTK的表达 A：1,2:βactin(42kD);B：1:转染pcChCDTK的Y79细胞，出现一条约59kD蛋白;2:未转染的Y79细胞。
存质量。因此，RB基因治疗的研究越来越为人们所重视，并且通过不同的治疗策略取得了一系列的研究进展。现阶段对RB基因治疗的研究主要集中在4种不同的基因上，包括自杀基因、抑癌基因、抗血管生成基因以及促凋亡基因。RB发生的分子机制还不是太清楚，而且与RB形成相关的抑癌基因凋亡诱导基因种类繁多，与肿瘤血管形成相关的诱导因子和抑制因子多种多样，且分子机制仍有待于进一步研究。我们选择双自杀基因CDTK作为目的基因，实施RB的自杀基因治疗。首先，自杀基因作为肿瘤基因治疗的候选基因，已经在多种肿瘤开展研究[27]。其表达产物和前体药物相互作用来实现肿瘤基因治疗的机制比较清楚。其次，自杀基因和前体药物相互作用产生的毒性物质能通过不同方式实现对邻近肿瘤细胞的旁杀效应，包括直接分泌到细胞外旁杀，或通过细胞间隙连接旁杀，或通过产生凋亡小体、免疫介导来实现旁杀。同时，目前的研究表明，自杀基因系统治疗RB是安全有效的[8]。我们设计的含有双自杀基因CDTK的载体通过电转染的方式导入了视网膜母细胞瘤细胞株Y79细胞。48h后，提取转染Y79细胞RNA，RTPCR的结果可见一403bp特异条带，与预期大小一致，显示双自杀基因CDTK在细胞中mRNA水平得到了表达。Western blot的结果也同样显示，载体转染的Y79细胞中，59kD的目的基因蛋白有明显的表达。这两个实验结果充分说明，我们构建的双自杀基因CDTK在靶细胞Y79中得到表达。先前的研究显示，被设计得的融合基因yCD/UPRT、大肠杆菌CDglyTK以及yCDglyTK具有最强的催化前体药物向细胞毒物转化的能力。我们通过HPLC检测5FU的浓度，上清中5FU的浓度平均含量为169mg/L，故5FC向5FU的转化效率约为84.5%，说明我们所构建的肿瘤特异性双自杀基因载体具有很强的催化前体药物向细胞毒性物质转化的能力。
双自杀基因疗法是将两种自杀基因整合在一起，通过载体转导进入肿瘤细胞，其在肿瘤细胞内表达的融合基因产物具备两种酶的活性。因此，双自杀基因疗法可以大大提高抑制肿瘤生长的功效，同时使得前体药物的用量减半。大量资料表明双前体药物对肿瘤细胞的杀伤作用要强于单前体药物。但也有资料显示双自杀基因之间可能存在拮抗效应。在体外实验中，单独加5FC的细胞杀伤最强，要高于5FC和GCV都加的组，而单独加GCV的细胞杀伤力最低， CD和TK之间没有协同作用，反而可能会相互干扰各自功能的运行。原因可能有两个方面：(1)可能是融合基因yCDglyTK在同时加5FC和GCV时，CD/5FC和TK/GCV两种系统的功能出现拮抗效应;(2)可能是在yCDglyTK融合基因中，由于某种原因，CD和TK的活性在这个融合基因中得到提高，使CD/5FC和TK/GCV两种系统的抑瘤能力同时或其中一种得到增强。当E.coli CD和HSV1 TK基因同时在一种细胞中表达时，会存在相互干扰作用。这种干扰作用的机制到目前还没搞清楚，但干扰作用可能不是发生在基因的转录期，而是在转录之后，TK介导的5FUMP的磷酸化会产生无毒的5FdUDP和5FdUTP，而不是毒性产物5FUDP和5FUTP，从而减低了CD/5FC的细胞毒性作用;或者CD介导的对GCV，ACV等的脱胺反应减低了TK/GCV系统的细胞毒性。yCD/UPRT基因中UPRT的酶活性与单独的UPRT酶活性大致相等，但是yCD/UPRT基因中的CD酶活性要高于单独CD酶活性100倍。这种酶活性的改变可能与这3种酶的蛋白质特性不同有关。加入不同浓度的前体药物5FC,GCV或5FC+GCV于电转了pcChCDTK的人视网膜母细胞瘤Y79细胞培养5d， SNK检验表明,与未转染的细胞对应浓度组比较，当5FC浓度达到100mg/L后各对应浓度平均细胞存活率组间均存在差异(P<0.05);与未转染的细胞对应浓度组比较，当GCV浓度达到8mg/L各对应浓度平均细胞存活率组间均存在差异(P<0.05);转染组间比较，当5FC达200mg/L,GCV达16mg/L后，3组间平均细胞存活率均有统计学差异(P<0.05)，细胞存活率大小为：5FC>GCV>5FC+GCV，既对双自杀基因转染的Y79细胞的杀伤作用大小顺序为：5FC+GCV >GCV >5FC。在本实验中，单前体药物对双自杀基因CDTK载体转染的Y79细胞均有杀伤作用，但双前体药物的杀伤作用要强于单前体药物。分析产生这种结果的原因，我们认为：(1)双自杀基因载体具有很强的催化前体药物向细胞毒物转化的能力;(2)这可能与我们加入的CMV增强子能大大促进hTERT启动子启动下游目的基因的表达有关，因为CMV增强子具有强大的增强转录能力，且没有组织特异性。
【参考文献】
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7朱文辉，谭万龙，黄河，等.CDTK双自杀基因系统对前列腺癌细胞的杀伤作用.南方医科大学学报2007;27(4)：479481
8 ChévezBarrios P，Chintagumpala M，Mieler W， et al. Response of retinoblastoma with vitreous tumor seeding to adenovirusmediated delivery of thymidine kinase followed by ganciclovir. J Clin Oncol 2005;23(31):79277935 上一页 [1] [2] |
