２ 结 果

    ２．１ 细胞形态及免疫荧光双染细胞鉴定

    接种２４ ｈ，绝大多数细胞贴壁，或三五聚集成团，或散在生长。部分活性较好的细胞伸出短小突起（图１Ａ）。随着时间延长，细胞突起延长，接种后７ ｈ神经细胞突起之间相互交织成网状，部分细胞胞体伸展成不规则形、梭形，胞体饱满，立体感强，边界清楚（图１Ｂ）。此后神经胶质细胞逐渐爬出，位于神经细胞的下方，色泽较灰暗，呈不规则片状，培养后２０ ｄ绝大多数细胞为神经胶质细胞。免疫荧光双染显示培养后第７天，绝大多数细胞ＮＳＥ阳性（图１Ｃ）。Ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ阳性的细胞约占半数（图１Ｄ）。

    ２．２ 谷氨酸对体外培养视网膜神经细胞的兴奋性毒性

    正常对照组的Ａ值为０．９７ ± ０．２３；１２ ｈ高浓度谷氨酸组的Ａ值为０．４８ ± ０．１３，低浓度组为０．５３ ± ０．２１。其余各时间点的Ａ值详见表１；经统计分析，从给予谷氨酸后２ ｈ开始，两个谷氨酸组的Ａ值与正常对照组相比差异都有显著意义。

    ２．３ ＭＴＴ法测定ＧＢ对视网膜神经细胞存活率的影响

    正常对照组Ａ值为０．８５ ± ０．０３，１００ μｍｏｌ／Ｌ谷氨酸（Ｂ组）作用１２ ｈ后Ａ值明显下降到０．５０ ± ０．０７（Ｐ≤０．０５），与Ａ组（正常对照组）相比神经细胞存活率降低到５７．４％。预先给予不同浓度的ＧＢ（Ｃ－Ｅ组）后视网膜神经细胞的Ａ值分别为０．５２ ± ０．０９、０．６４ ± ０．１５和０．７４ ± ０．１１。各组的Ａ值变化趋势见图２。

    ２．４ Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ／ＰＩ 细胞凋亡检测

    正常对照组神经细胞凋亡率为５．５％；谷氨酸组凋亡率达到５２．４％；１０、５０和１００ μｍｏｌ／Ｌ 的ＧＢ组的凋亡率分别为３６．７％，１２．４％和２．１％（图３）。

    ２．５ 流式细胞仪检测线粒体膜电位变化

    各组细胞经ＪＣ-１染色后，通过流式细胞仪检测红色荧光和绿色荧光平均荧光强度的变化（红／绿），从而间接反映线粒体膜电位的变化。谷氨酸诱导后，神经细胞红／绿比值为１．７７，显著低于正常对照组；预先给予１０ ～ １００ μｍｏｌ／Ｌ ＧＢ后红／绿比值逐渐增加，见图４。

    ３ 讨 论

    研究表明谷氨酸兴奋性毒性作用与青光眼和糖尿病性视网膜病变等的发病机制息息相关［７－９］。Ｃｌａｒｋｅ等认为在视网膜变性疾病中感光细胞变性可能是与谷氨酸等兴奋性氨基酸在局部积聚有关［３］。这一假说也在视网膜变性模型ｒｄ１小鼠中得到证明，应用谷氨酸受体拮抗剂ＣＮＱＸ可以抑制ｒｄ１小鼠视杆细胞的凋亡［１０］。由此可见，谷氨酸兴奋性毒性作用与视网膜变性的发病密切相关。

    关于谷氨酸诱导凋亡的浓度，目前没有统一的标准。我们采用ＭＴＴ法观察文献常用的两种浓度１００ μｍｏｌ／Ｌ和１ ｍｍｏｌ／Ｌ在不同作用时间下对体外培养的大鼠视网膜神经细胞的影响，以建立合适的视网膜神经细胞凋亡模型。结果发现，１００ μｍｏｌ／Ｌ和１ ｍｍｏｌ／Ｌ谷氨酸作用下，随时间延长培养的视网膜神经细胞存活率逐渐降低，但是前者的下降趋势与１ ｍｍｏｌ／Ｌ组相比更加缓和，到１２ ｈ还有约５４％的细胞存活。由于我们的实验目的是观察银杏内酯Ｂ对谷氨酸诱导的视网膜神经细胞凋亡的保护作用，药物有一定的起效时间，所以我们认为选择更加缓和的致凋亡作用比较合适。

    到目前为止，导致光感受器细胞凋亡的机制尚不十分明确。大量的研究表明，线粒体在调控细胞凋亡中起关键作用［１１－１２］：线粒体膜通透性的改变是多种促细胞凋亡级联转导信号的枢纽，线粒体跨膜电位Δψｍ的破坏，被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件之一，它发生在细胞核凋亡特征（染色质浓缩、ＤＮＡ 断裂）出现之前，一旦线粒体跨膜电位崩溃，则细胞凋亡不可逆转。

    本实验中ＭＴＴ和Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ／ ＰＩ的结果均显示，１００ μｍｏｌ／Ｌ的谷氨酸可以导致视网膜神经细胞存活率降低，凋亡率增加；预先给予不同浓度的银杏内酯Ｂ可以拮抗谷氨酸的致凋亡作用，在１０ ～ １００ μｍｏｌ／Ｌ范围内该作用具有剂量依赖性；ＪＣ-１的结果表明ＧＢ抑制谷氨酸的致凋亡作用可能是通过提高线粒体跨膜电位，从而阻断下游的凋亡级联反应，抑制凋亡相关因子的释放而实现的。

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