作者：王静波，惠延年，关娟，周历 作者单位：1.解放军总医院第二附属医院 眼科，北京 100091； 2.第四军医大学西京医院 眼科，陕西 西安 710032
【摘要】 目的 观察剪切力对体外培养的人视网膜色素上皮（retinal pigment epithelial，RPE）细胞c-fos和c-myc基因mRNA表达的影响。方法 用2 dyne/cm2的剪切力作用于体外培养的人RPE细胞，作用时间分别为0、0.25 h、0.5 h、0.75 h、1 h、1.5 h和3 h，采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）观察c-fos和c-myc mRNA的表达变化，并采用单因素方差分析比较各时间点之间表达的差异。结果 2 dyne/cm2的剪切力作用0.75 h后，RPE细胞的形态开始发生变化，包括细胞间隙增大、细胞皱缩和脱落。剪切力作用1.5 h及以上时间，细胞极性改为与流动方向一致。在未受剪切力作用的RPE细胞中，c-fos mRNA表达水平低。随着剪切力的作用时间的延长，c-fos mRNA的表达逐渐增强，于1.5 h时达峰值，随后开始减弱。剪切力作用3 h时，RPE细胞c-fos mRNA的水平仍显著高于未受剪切力作用时的水平。在未受剪切力作用的RPE细胞中，c-myc mRNA表达水平较低。剪切力作用1.5 h时，c-myc mRNA的表达增强至峰值，随后开始减弱，但在作用3 h时，c-myc mRNA的表达仍高于未受剪切力作用时的RPE细胞的c-myc mRNA的水平。结论 2 dyne/cm2的剪切力可改变RPE细胞的形态，在短时间内可快速增强RPE细胞c-fos和c-myc mRNA的表达。与c-myc相比，c-fos对剪切力的反应更迅捷，增强幅度更大。
【关键词】 视网膜色素上皮；剪切力；c-fos；c-myc
Effect of shear stress on the expression of c-fos and c-myc mRNA in cultured human retinal pigment epithelial cells
WANG Jingbo*， HUI Yannian， GUAN Juan*， et al.
* Department of Ophthalmology， Second Affiliated Hospital， General Hospital of Chinese People’s Liberation Army， Beijing China， 100091
［Abstract］ Objective To investigate the effect of shear stress on the expression of c-fos and c-myc mRNA in cultured human retinal pigment epithelial (RPE) cells. Methods RPE cells were exposed to shear stress of 2 dyne/cm2 for 0， 0.25， 0.5， 0.75， 1， 1.5， and 3 h. Reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) was used to detect the levels of c-fos and c-myc mRNA in RPE cells. One-way analysis of variance was used to compare the differences. Results After exposure to shear stress for 0.75 h， the morphology of the RPE cells began to change： paracellular spaces widened， cells were deformed and detached. After exposure to shear stress for more than 1.5 h， cellular polarity changed with the direction of the force. The c-fos mRNA was weak in RPE cells that were not exposed to shear stress. With exposure to 2 dyne/cm2 of shear stress， c-fos mRNA increased gradually， and reached a peak at 1.5 h， then subsequently decreased. When exposed to shear stress for 3 h， the c-fos mRNA in RPE cells was still higher than that of cells that were not exposed to stress. With treatment of 2 dyne/cm2 of shear stress， c-myc mRNA reached a peak at 1.5 h， and then slightly decreased. The expression of c-myc mRNA at 3 h was still higher than that in cells that were not treated with stress. Conclusion Shear stress of 2 dyne/cm2 can change the morphology of RPE cells， and quickly up-regulate c-fos and c-myc mRNA within a short period of time. Compared to c-myc， c-fos increases faster， and peaks at a higher level.
［Key words］ retinal pigment epithelium； shear stress； c-fos； c-myc
生物体，无论是动物、植物还是微生物，时刻处于各种机械力的作用下。这些力影响并调节生物体的生长、发育、生理功能甚至基因的表达和调控[1]。在动物（包括人类）中，眼球处于不断的运动中，这期间有多种力的作用。其中，玻璃体会对视网膜产生剪切力和牵拉力等，这些力可通过视网膜的细胞外基质传至其下的视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）层，从而影响RPE细胞的生物学表现[2]。在细胞的生物学性状变化中，早期基因的改变起着重要的作用。c-fos和c-myc是两个重要的核转录因子，属于即刻早期反应基因家族[3]，是与多数细胞增殖有关的原癌基因。在本实验中，我们欲研究剪切力在短时间内对体外培养的人RPE细胞c-fos和c-myc表达的影响。
1 材料和方法
1.1 材料 Dulbecco改良Eagle培养基（Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM）、RPMI 1640培养基（美国Hyclone公司），新生小牛血清（杭州四季清公司），Trizol试剂（美国Invitrogen公司），反转录试剂盒（美国Promega公司），Taq酶（美国MBI公司），其他试剂均为国产或进口分析纯。c-fos和c-myc引物由上海生工合成。实验所需的RPE细胞来源于3个不同个体成年健康男性的眼球。
1.2 方法
1.2.1 引物合成 c-fos引物：上游5′ TGCTGAAGGAGAAGGAAAAA 3′，下游5′ TGCATAGAAGGACCCAGATA 3′；c-myc引物：上游5′ TGCTGCATGAAGAGACACCG 3′，下游5′ TTTCAACTGTTCTCGCCGTT 3′；甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）引物：上游5′ GAAGTGAAGGTCGGAGTCA 3′，下游5′ TTCACACCCATGACGAACAT 3′。
1.2.2 RPE细胞培养 取意外死亡正常成人供体眼球3个，于12 h内用于RPE细胞培养。具体方法如下：将眼球用含50 ?滋g/ml庆大霉素的D-hanks液冲洗2次，置于眼托上。在锯齿缘后以360°剪开眼球，去除玻璃体和视网膜组织。剩余的眼杯用D-hanks液洗2次，加入0.25%胰蛋白酶，于37℃消化1 h。用弯头吸管轻轻吹打使细胞脱落，将含有RPE细胞的消化液移入预先加有20%新生牛血清的DMEM的离心管中，终止胰酶反应。重复消化1次，将RPE细胞悬液离心5 min，1000 r/min。弃上清，加入20%新生牛血清的DMEM，将细胞密度调整到5×104个/ml，接种于培养瓶，于37℃、5%CO2孵箱培养。3～5 d换液，待细胞融合后，按1∶3传代。传代细胞用含10%新生牛血清的DMEM培养。取第4～第8代细胞用于实验。
1.2.3 流动小室建立及使用 剪切力模型的整个实验系统由流动小室、恒流泵、医用硅胶管道、储液瓶构成。灌流液由恒流泵泵出后经管道流入流动小室，对RPE细胞施加剪切力，再经管道回到储液瓶中。整套系统置于37℃恒温的CO2培养箱中。流动小室参考Theilmeier等[4]的实验装置并加以改进。小室宽1.2 cm，高0.2 cm，由上、下、左、右四块有机玻璃构成，下层有机玻璃为细胞玻片放置处。
RPE细胞消化后，接种于预先切割好的合适大小的盖玻片上，置CO2孵箱中培养，当细胞接近完全融合后，于无菌条件下取出玻片放于流动小室中进行实验。系统通过恒流泵控制循环流量，使剪切力的大小为2 dyne/cm2。实验在37℃、CO2孵箱中进行，灌流液为含10％新生牛血清的DMEM。2 dyne/cm2剪切力作用于体外培养的RPE细胞的时间分别为0、0.25 h、0.5 h、0.75 h、1 h、1.5 h和3 h。
剪切力作用不同时间后，于光学显微镜下观察细胞形态的变化。
1.2.4 细胞mRNA的提取及逆转录聚合酶链反应（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR） 剪切力作用结束后，以37℃预热的无菌磷酸盐缓冲液轻柔洗一次，然后收集细胞备用。收集的细胞用Trizol提取总RNA，反转录合成cDNA第1链，对产物进行PCR。退火温度分别为c-fos：54℃，1 min；c-myc：54℃，1 min；GAPDH：55℃，1 min。GAPDH反应为30个循环，c-fos和c-myc反应为35个循环。PCR产物以1%琼脂糖凝胶电泳，于紫外灯下观察照相。采用Kodak Digital Science 1D分析软件分别读取各片段灰度值，以c-fos的灰度值与GAPDH灰度值的比值代表c-fos mRNA的水平，以c-myc的灰度值与GAPDH灰度值的比值代表c-myc mRNA的水平。实验重复3次，取各时间点的平均表达水平作为其最终水平。
1.3 统计学方法 采用SPSS13.0统计分析软件，对RPE细胞受剪切力作用后不同时间点间c-fos和c-myc mRNA的比较进行单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。绘图采用Origin 7.0软件。
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