【摘要】
目的：建立一种新的植入式颅骨电极记录大鼠视觉诱发电位（visual evoked potential, VEP）的方法，同时应用于RCD大鼠及CSNB大鼠，看是否可行。
方法：大鼠麻醉后，暴露颅骨表面，分别在前囟（bregma）前4mm和后8mm处钻孔，植入长2mm，直径1.2mm的不锈钢螺钉，分别作为参考和记录电极；接地电极接入尾部。记录暗适应和明适应下视觉诱发电位（刺激光强：0.011，0.035，0.11，0.35，1.1和3.5cd·s/m2，叠加100次，不同光强间隔2～5min，刺激频率1Hz，时程300ms）。1wk后，以同样条件再次记录暗适应和明适应下视觉诱发电位。
结果：植入电极后的大鼠存活时间较长，能达数月。记录时基本无干扰，波形清晰，稳定。植入法记录的波形与传统方法记录（记录电极插于两耳连线中点，向前刺入1～1.5cm，保持电极与身体长轴平行；参考电极由不锈钢针制成，插入右侧颊部；接地电极也由不锈钢针制成，置于尾部，对侧眼遮盖。）的波形没有差异，但幅值明显增大。在视锥细胞缺失（RCD）及先天性静止性夜盲（CSNB）大鼠中得到了同样的结果。
结论：由于电极可以长期留置于大鼠上，有利于观察其视觉诱发电位的动态改变，对长期病程变化的研究也非常有利，同时记录和参考电极的位置固定，两者之间的相对位置也无变化，可大大减少实验误差，提高结果的可重复性及精确性。
【关键词】 视觉诱发电位 植入颅骨电极 大鼠
0引言
视觉诱发电位（visual evoked potential, VEP）主要是视觉信号引起的视皮层神经元电活动，它可以使用图形或闪光刺激。图形视觉诱发电位（pattern visual evoked potential, PVEP）比较稳定，主要反映视网膜后极部信号至视皮层的传导情况［1］。相比之下，闪光刺激一般由氙灯产生，其波形在正常人中的差异较大，使得其正常值范围难以确定，限制了在临床的使用［2］。对于大鼠存在同样问题，传统记录方法记录的FVEP及PVEP波形在个体间变异较大，且重复性不好，我们比较国外文献建立了一种新的植入式颅骨电极记录大鼠VEP的方法。
1材料和方法
1.1材料 二级雄性SD，RCD，CSNB大鼠各10只，第四军医大学实验动物中心及本实验室自己保存，鼠龄约7wk，体质量150～200g，外眼及检眼镜检查无异常。予以12h明暗交替光照，不限食水，室温保持在22～25℃。随机分为2组，1组6只，予以植入电极；另1组4只，以传统方法记录VEP。
1.2方法 大鼠用速眠新II注射液0.6mL/kg（解放军农牧大学兽医研究所）ip麻醉，固定于动物手术台上。头颈部背皮，碘伏消毒，沿中线切开约1.5cm长的皮肤，清除皮下组织，暴露颅骨表面。分别在前囟（Bregma）前4mm和后8mm处钻孔，植入长2mm，直径1.2mm的不锈钢螺钉。缝合后，记录暗适应和明适应条件下的视觉诱发电位。1wk后，以同样条件再次记录暗适应和明适应下视觉诱发电位。两组大鼠都给予12h以上的暗适应，实验前5g/L托品酰胺散瞳，速眠新Ⅱ注射液0.6mL/kg ip麻醉。植入电极大鼠，前囟后8mm处用丝状银－氯化银电极引出导线接于记录电极，前囟前4mm用丝状银－氯化银电极引出导线接于参考电极，接地电极为针状，接于尾部。另一组使用传统方法进行记录，记录电极由不锈钢针制成，置于双耳连线中点，向前刺入1～1.5cm，保持电极与身体长轴平行；参考电极由银丝制成，置于嘴中；接地电极也由不锈钢针制成，置于尾部。对侧眼遮盖，采用Retiport系统（Roland Consult System，德国）进行记录暗适应状态0.011，0.035，0.11，0.35，1.1和3.5cd·s/m2及明适应状态0.011，0.035，0.11，0.35，1.1和3.5cd·s/m2的视觉诱发电位。叠加100次，不同光强间隔2～5min，刺激频率1Hz，波形时间250ms，通频带0.5～300Hz。主要观测主波的波幅（μV）、潜伏期(ms)，作定量分析。
统计学处理：应用SPSS12.0统计软件进行统计处理。
2结果
正常SD，RCD及CSNB大鼠在暗适应和明适应状态下均能记录出满意的波形。随着光强增加，幅值呈现增加—较少的趋势。
2.1 SD大鼠 可以看出植入电极记录出的波形与传统方法记录的没有明显差异，但幅值要大的多。同时植入电极在记录时基本无干扰，叠加15次左右即可获得满意波形，而传统方法记录需30次以上（图1 A，B）。以传统方式记录到的SD大鼠的VEP波的潜伏期和幅值与以植入电极方式记录到的波的潜伏期和幅值比较有显著性差异（P<0.05，表1）。SD大鼠明、暗适应条件下，通过传统方法记录到的视觉诱发电位和颅骨植入电极方法记录到的电极存在显著性的差异，幅值明显增大。这样使用植入电极法可以方便、快捷、重复的记录到电位变化。而且记录到的波形更清晰。而植入电极后的SD大鼠的潜伏期相较于传统记录方法没有明显差异。
图1 正常SD大鼠记录出的闪光视觉诱发电位波形（略）
A:传统方法; B:植入电极
表1 SD大鼠传统方法和植入电极方法的VEP波的潜伏期和幅值比较 （略）
aP<0.05vs传统方法组
2.2 RCD大鼠 以传统方式记录到的RCD大鼠的暗适应条件下的VEP波的潜伏期和幅值与以植入电极方式记录到的波的潜伏期和幅值比较（P<0.05，表2，图2 A，B）。在RCD大鼠中，在明适应和暗适应条件下，通过传统方法记录到的视觉诱发电位和颅骨植入电极方法记录到的电极存在显著性的差异，幅值明显增大。这样使用植入电极法可以方便、快捷、重复的记录到电位变化。而且记录到的波形更清晰。而植入电极后的RCD大鼠的潜伏期相较于传统记录方法没有明显差异。
图2 RCD大鼠记录出的闪光视觉诱发电位波形（略）
A:传统方法;B:植入电极
表2 RCD大鼠传统方法和植入电极方法的VEP波的潜伏期和幅值比较（略）
aP <0.05vs 传统方法组
2.3 CSNB大鼠 以传统方式记录到的CSNB大鼠的暗适应条件下的VEP波的潜伏期和幅值与以植入电极方式记录到的波的潜伏期和幅值比较（P<0.05，表3，图3 A，B）。而对于CSNB大鼠，与SD大鼠比较发现，其明适应和暗适应条件下测得的幅值均较低。暗适应条件下，通过传统方法记录到的视觉诱发电位和颅骨植入电极方法记录到的电极存在显著性的差异，幅值明显增大。这样使用植入电极法可以方便、快捷、重复的记录到电位变化，记录到的波形更清晰。暗适应条件下记录到的幅值有所增大，但差异不明显。暗适应和明适应条件下分别记录到的潜伏期，部分光强刺激后记录的植入电极后的大鼠的潜伏期相较于传统记录方法有明显差异，潜伏期提前，其余没有差异。
图3 CSNB大鼠记录出的闪光视觉诱发电位波形（略）
A:传统方法;B:植入电极
表3 CSNB大鼠传统方法和植入电极方法的VEP波的潜伏期和幅值比较 （略）
aP <0.05vs 传统方法组
3讨论
临床视觉电生理学检查是一种客观的检查方法，可用于对动物视觉电生理功能的评定。但因生理、物理等因素的改变，正常视觉电生理指标的形状和特性有很大差异，各实验室的正常值变异也较大。在实验中我们通过控制动物麻醉深度、固定电极放置、调节室内温度、环境照度等一系列措施，使实验中的各种客观因素的影响降到最小，而使电生理指标最大限度的反映动物视神经系统的机能状态。FVEP是用光刺激视网膜后，通过视路传递，在枕叶视皮层诱发出的电活动［3］。它反映出视网膜神经节细胞到视皮层的功能状态，是对视路功能的客观的检查方法，其正常与否决定于是否具有正常的视网膜，是否具有正常传导功能的视神经、外侧膝状体和视放射纤维，以及正常功能的视皮层［4］。我们的主要观察指标为主波的潜伏期和振幅。潜伏期的长短反映神经传导途径中是否有阻滞的存在，而振幅则主要反映视网膜后极部的感受机能，同时也受到中枢传导功能的影响 。
SzaboSalfay等［5］报道使用螺钉电极进行大鼠视觉诱发电位的记录，但其参考电极与我们放置的不一致。我们选择了前囟前4mm处作为参考电极的放置点，因为此处颅骨下空隙较大，与视皮质中枢的距离合适［6］。前囟后8mm为大鼠视皮质区域的中心点，是本实验放置记录电极的位置，可以保证电极收集的信号来源于视皮质，减小干扰。此方法也适用于清醒状态大鼠的VEP记录，与国外的相关研究比较［7］，本方法由于螺钉与颅骨连接牢固，可以长期留置于大鼠上，从而可以动态观察其VEP的改变，对长期观察病程变化非常有利，同时由于记录和参考电极的位置固定，两者之间的相对位置也无变化，可大大减少实验误差，提高结果的可重复性。
本实验中SD大鼠和RCD大鼠在明适应和暗适应条件下，颅骨植入电极方法记录到的视觉诱发电位与传统方法记录到的视觉诱发电位相比，幅值明显增大，潜伏期基本无差异。而CSNB大鼠在暗适应条件下应用此法记录到的波形幅值明显增大，而明适应条件下记录到的波形幅值有增大，但无明显差异。说明此方法在SD大鼠和RCD大鼠中应用更合适。CSNB大鼠记录到的波形的幅值明显的小于SD大鼠和RCD大鼠。说明其视神经传导通路存在某些障碍，这有待进一步的研究确定。
【参考文献】
1 Fishman GA, Birch DG, Holder GE, Brigell MG. Electrophysiology testing. Second edition. The Foundation of the American Academy of Ophthalmology,2001;237267
2 SzaboSalfay O, Palhalmi J, Szatmari E, Barabas P, Szilagyi N, Juhasz G. The electroretinogram and visual evoked potential of freely moving rats. Brain Res Bull,2001;56(1):714
3 Song WQ, Tan Q, Xia ZH. Spatial characteristics of flash electroretinogram in normal subjects. Int J Ophthalmol(Guoji Yanke Zazhi),2007;7(2):438441
4 Zhou X, Shu HL. Analysis of visual aculity with VEP technology. Int J Ophthalmol(Guoji Yanke Zazhi),2007;7(1):124126
5 Goto Y, Furuta A, Tobimatsu S. Magnesium deficiency differentially affects the retina and visual cortex of intact rats. J Nutr,2001;131(9):23782381
6 Brankatk J, Klingberg F. Behaviourdependent changes of visually evoked potentials and their correlation to the respiration rate in freely moving rats. Acta Biol Med Ger,1982;41:315324
7 Brankatk J, Schober W, Klingberg F. Different laminar distribution of flash evoked potentials in cortical areas 17 and 18 b of freely moving rats. J Hirnforsch,1990;31(4):525533 |
