【摘要】 观察高浓度葡萄糖对体外培养的大鼠视网膜Müller细胞P2Y2受体表达的影响。方法：用改进的酶消化法纯化培养并用胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)和谷氨酰胺合成酶（GS）鉴定大鼠Müller细胞。分别在对照组（5.5mmol/L）与高糖组（10,25，50mmol/L）中孵育24h和72h，通过免疫荧光及荧光强度半定量分析检测Müller细胞中P2Y2受体表达的变化。结果：纯化培养到第3～4代的Müller细胞，经鉴定纯度大于90%,表达GFAP和GS。在24h，10，25，50mmol/L组的荧光强度分别为31.05±7.06，59.17±11.42和84.11±12.72，与对照组(26.60±5.15)相比较均明显增高（P<0.01）。而在72h，仅25和50mmol/L组的荧光强度明显强于对照组（P<0.01）。结论：高浓度葡萄糖上调大鼠视网膜Müller细胞P2Y2受体的表达，提示这一受体可能参与糖尿病视网膜病变过程。
【关键词】 2Y2受体 Müller细胞 高浓度葡萄糖
0引言
糖尿病视网膜病变是糖尿病最严重的并发症之一，是导致成年人盲的主要原因之一，其发病机制目前尚不十分清楚。研究发现在视网膜血管病变发生之前，已有视网膜神经变性，包括视网膜神经元及神经胶质细胞的变性及丢失[1]。Müller细胞是视网膜中一种重要的神经胶质细胞，其细胞体从内界膜一直贯穿至外界膜，广泛分布在神经元胞体和纤维之间，与神经元的关系极为密切，在视网膜的整个功能活动中起着重要作用，也易受病理因素的影响[2]。在糖尿病视网膜病变的发生发展过程中，Müller细胞也起到了重要的作用。
P2Y2受体是嘌呤受体亚型P2Y受体的一种，属于G蛋白偶联受体，激活后的P2Y2受体可以活化如磷脂酶C、IP3、钙离子等活性物质。还能够活化多条信号通道，如PKC、磷酯酶A2、依赖钙离子的钾离子通道等。在培养的兔视网膜Müller细胞中存在P2Y2受体[3]。有研究表明，在某些细胞病理过程中可能有P2Y2受体表达的变化[4]。
高血糖是导致糖尿病视网膜病变许多损害的主要原因之一，糖尿病危险因素及流行病学调查表明，血糖的高低与病变严重程度呈正相关[5]。高浓度的葡萄糖能够引起视网膜Müller细胞结构和功能上的很多变化[6,7]。但是否引起P2Y2受体表达的变化，尚未见报告。本实验的目的是检测不同浓度的葡萄糖条件下体外培养的视网膜Müller细胞中P2Y2受体的表达变化。
1材料和方法
1.1材料
健康封闭群二级新生（生后5～7d）SD大鼠10只，由第四军医大学实验动物中心提供。DMEM（低糖）购自Hyclone公司；胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)购自Gibco公司；胶质原纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein. GFAP）抗体购自北京博奥森公司；P2Y2受体抗体购自Sigma公司；谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase,GS）抗体购自abcam公司；FITC标记的山羊抗兔IgG购自北京中衫公司；其它化学试剂均为国产分析纯试剂。
1.2方法
1.2.1大鼠视网膜Müller细胞的原代培养与鉴定
参照李树宁等[8]、Hicks等[9]制备视网膜Müller细胞的方法，简言之，眼球取出后，显微镜下无菌操作取出视网膜神经上皮层，Dhanks液冲洗，2.5g/L的胰蛋白酶2mL中37℃消化20min，加入含200mL/L FBS的DMEM，53μm孔径的尼龙筛网过滤，滤液离心（1000r/min）5min，接种于培养瓶中，于37℃，50mL/L CO2浓度孵箱中培养，每3天换液，待细胞融合，2.5g/L胰蛋白酶消化、洗涤，继续培养2～3遍。细胞形态基本一致后，按1∶2传代，传代后改用含100mL/L FBS的DMEM继续培养，传至3～4代后用于鉴定和实验。采用免疫荧光染色鉴定视网膜Müller细胞，一抗为兔抗大鼠GFAP抗体和兔抗大鼠谷氨酰胺合成酶（GS）抗体，工作浓度分别为1∶200和1∶5000。细胞纯度分析：计算单位视野内GFAP表达阳性的细胞占总细胞的比例。
1.2.2 Müller细胞高糖模型的建立及试验分组
在24孔培养板中预置盖玻片，将3～4代Müller细胞按照5×107/L的密度接种，待细胞生长接近融合时，改用不含FBS的低糖DMEM培养基（葡萄糖浓度为5.5mmol/L）培养24h，然后按照以下葡萄糖浓度分组：5.5，10，25，50mmol/L，每组设6个复孔，经过24,72h观察结果。
1.2.3免疫荧光法检测Müller细胞P2Y2受体的表达
将制好的的细胞爬片取出，用PBS清洗，40g/L多聚甲醛固定30min，PBS清洗，1g/L TritonX100液体处理1h，PBS冲洗，40mL/L山羊血清封闭30min，加入兔抗大鼠P2Y2受体抗体，工作浓度为1∶200，空白对照组加PBS(0.01mmol/L, pH7.2)，4℃保湿过夜，PBS洗涤，加入 FITC标记的山羊抗兔IgG抗体，工作浓度为1∶100，37℃保湿60min，PBS清洗，甘油封片，荧光显微镜观察并照相。
1.2.4细胞免疫荧光强度判定
免疫荧光图像分析：每组取3张爬片，每张爬片随机选取5个视野进行分析，在每个视野中选取10个细胞，应用图像分析软件ImagePro Plus 6.0测量每个细胞的荧光强度，取平均值作为该标本P2Y2受体的相对表达量。
统计学处理：结果用均数±标准差表示，采用SPSS 11.0软件统计数据，每个时间点中组间差异判断采用单因素方差分析，两个时间点间总体差异采用随机区组设计资料的方差分析，α=0.01。
2结果
原代培养的细胞在接种后24h内贴壁逐渐铺展，形态以成纤维细胞样为主，胞体狭长，有较多突起，核呈圆形或卵圆形（图1A）；少量呈上皮细胞样。原代细胞一般14～21d长满，经酶消化法纯化后，按1:2比例传代，传代后细胞周期缩短至10～14d，经过2次传代后细胞形态较一致，胞体较原代细胞大，折光性增强，细胞形态扁平不规则，胞质内原纤维较丰富，胞突的分支少而短，有清晰的圆形或卵圆形细胞核（图1B）。对3～4代细胞进行GFAP抗体及GS抗体染色，均显示绿色荧光，为阳性表达(图1C，1D)。纯化培养至第3代的Müller细胞，经鉴定其纯度为90％以上。不同葡萄糖浓度对Müller细胞P2Y2受体表达有明显的影响。在24h，随葡萄糖浓度增加，Müller细胞P2Y2受体的表达明显增强。阴性对照无荧光染色。测得的对照组，10，25，50mmol/L组的荧光强度，分别为26.60±5.15，31.05±7.06，59.17±11.42，84.11±12.72，各高糖组与对照组之间相比较，均有显著差异（P<0.01）（图2）。在72h，对照组，10，25，50mmol/L组的荧光强度分别为26.91±4.88，26.24±5.40，75.34±11.26，96.43±15.55，25mmol/L和50mmol/L组与对照组相比较，有显著统计学差异（P<0.01），但10mmol/L组与对照组比较没有显著性差异（P=0.574，图3）。两个时间点的数据间相比较总体上有显著性差异（F=92.439,P<0.01，图4）。
3讨论
在本实验中，我们成功分离、纯化培养了大鼠视网膜Müller细胞，并对体外培养的Müller细胞给予不同浓度葡萄糖的处理，观察了P2Y2受体表达的变化。
P2Y2受体是嘌呤受体亚型P2Y受体的一种，首先是在小鼠NG10815神经母细胞瘤中被克隆出来[10]，属于G蛋白偶联受体，其信号传导途径为Gq/11/PLC/Ca2+/PKC,Gi/o/AC/cAMP，其激动剂效价顺序为ATP＝UTP>2MeSATP>ADP[11]。激活P2Y受体可以导致细胞内游离钙离子的增加和细胞外钙离子的内流，细胞内钙离子的增加活化BK通道，而BK通道的活化可能支持了钙离子的内流和对DNA合成的活化[12]。正常情况下，P2Y2受体的表达是偏低的，当受到病理因素的影响时，其表达和相应的功能是增强的，Turner等[4]证实当结扎大鼠一侧下颌下腺分泌导管后，结扎侧唾液腺细胞的P2Y2样受体活性和P2Y2受体mRNA水平相对于未结扎侧的是升高的。而Ballerini等[13]发现在缺乏葡萄糖和低氧环境中的星形胶质细胞P2Y2受体mRNA含量有明显的增加。Müller细胞也表达P2Y受体[12]，但在糖尿病视网膜病变中P2Y2受体的表达情况还不清楚。
体外25～30mmol/L葡萄糖浓度近似于糖尿病时体内的高糖状态，在本实验中，我们观察到了10mmol/L葡萄糖浓度条件下只在24h出现P2Y2受体表达的轻度增高，而72h后与对照组没有显著性差异，原因可能是本次试验的大鼠Müller细胞一直是用含100mL/L胎牛血清的低糖DMEM培养基（葡萄糖浓度与对照组相同）培养，撤除胎牛血清后，该细胞的营养来源主要是DMEM培养基中的葡萄糖和谷氨酰胺等，葡萄糖浓度的轻度增加改善了其营养状态，所以在早期有P2Y2受体的表达的轻度增加。而在25，50mmol/L葡萄糖浓度条件下均有P2Y2受体表达的明显增加，并随时间的延长表现为表达的增强，说明在模拟糖尿病状态的葡萄糖浓度条件下，会有P2Y2受体表达的变化。Müller细胞是一种重要的内环境调节细胞，糖尿病过程中体液里增高的葡萄糖浓度可能会增加其P2Y2受体的表达，而P2Y2受体表达的增加可能会引起其功能的上调，增加细胞内游离钙离子浓度，引发多种下游通路的活化，如GTP酶的激活[14]、MAPK的磷酸化和NFκB的易位[15,16]等，进而改变Müller细胞自身的多种功能，影响糖尿病视网膜病变的发展。
本实验只是初步对P2Y2受体在不同的糖浓度条件下表达的免疫荧光半定量分析，而糖尿病视网膜病变中P2Y2受体变化所起到的作用还需要进一步研究。
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