【摘要】 目的：可变氧环境下形成SD大鼠ROP模型，为动物实验研究提供ROP模型。
方法：将新生24只SD乳鼠及母鼠放入密闭氧箱内饲养，箱内氧浓度为400，800mL/L各12h交替循环14d，再将大鼠放至正常氧环境下饲养；间接检眼镜观察高氧后SD鼠眼底变化；视网膜血管内皮细胞ADPase酶组化染色。
结果：间接检眼镜观察发现17只SD大鼠在结束高氧环境1～3d，周边部视网膜血管呈毛刷状、无血管网，5d视网膜周边部开始出现血管网并有出血；2mo后，视网膜血管染色显示：视网膜毛细血管密度增加，血管扩张、管壁变薄、迂曲并有大量血管芽。
结论：可变氧环境下形成ROP模型成型率可达66.7%，间接检眼镜检查法可排除非ROP模型。
【关键词】 可变氧环境 ROP模型 ADPase染色
0引言
随着医学的发展，对于早产儿视网膜病变(ROP)的认识已经较为深入。它的发生和新生儿低体质量、吸氧和早产等多种因素有关。目前国内外眼科学家在积极探寻预防、治疗ROP疾病理想方案。产后3wk新生鼠的视网膜发育与人孕36wk的胎儿相似[1]，因此用新生大鼠作ROP模型在这些研究中起着重要作用。在国外，形成ROP模型所需氧浓度调节是由计算机调控，饲养箱内湿度，酸碱度也会及时得到调整，他们采用SD新生鼠形成的ROP模型成行率较高达67%。但是其设备极其昂贵。本实验中，我们尝试人工调节的方法改变饲养箱内的氧浓度、湿度、酸碱度、观察SD大鼠ROP模型形成及成行率，为ROP疾病的研究提供动物模型。同时采用间接检眼镜观察在高浓度氧下，视网膜血管的变化。
1材料和方法
1.1材料
氧气瓶及氧压力表，氧浓度表（上海学联仪表厂生产），饲养箱（80cm×60cm×50cm，设有进气孔和测量孔及气压平衡孔）由黎晓新教授设计，北大人民医院技工班生产， SD孕鼠2只（24只仔）购自北京大学医学部动物中心，动物属于二级清洁动物。间接检眼镜，手术显微镜，眼科手术器械，干燥剂，载玻片由中心实验室提供。ADP、兔抗大鼠抗体和Tris碱购自Sigma公司，福尔马林，氯化镁、硝酸铅、马来酸为化学分析纯，双星明散瞳药。SABC试剂盒购自中山化学试剂公司，实验所用照相器材由北京大学人民医院中心实验室提供。
1.2方法
将母鼠及新生SD仔鼠（24只）放在含氧400，800mL/L饲养箱内各12h，每24h为1个循环，交替进行饲养14个循环。每天更换饲养箱内垫料，并要求保持箱内比较干燥、酸碱度基本维持在正常范围中。再将其放至室内氧环境下饲养[2]。在正常氧环境第1～14d幼鼠腹腔内注入氯胺酮0.3μL，双眼各点滴双星明1滴，瞳孔散大后间接检眼镜下观察视盘周围及周边视网膜血管的变化。视网膜血管内皮细胞ADPase酶表达[3]:断颈处死24只经过可变氧环境SD幼鼠及其母鼠取眼球置于40°C PBS溶液中。沿角巩膜缘后1mm环绕一周剪掉角膜、分离虹膜、睫状体、取出晶状体及玻璃体。用角膜异物针伸入视网膜下沿着平齐巩膜缘环绕1周，小心地分离视网膜，分至视盘时角膜异物针紧贴巩膜，轻轻用力向上，将视网膜完整分离下来。尽可能去掉视网膜上残存玻璃体用PBS反复冲洗。将分离好的视网膜轻轻放在NBF液中4℃过夜。用50mmol/L TrisMaLeate缓冲液(pH7.2)洗15min×5次。在孵育液10mL中加入ADP10mg（ADPase孵育液配制3.0mmol/L硝酸铅6.0mmol/L氯化镁溶于0.2mol/L TrisMaleate缓冲液pH7.2）此溶液要求新鲜配制过滤，在使用时加热到37℃。将盛有视网膜孵育液放置摇床上轻轻搅摇动孵育15min然后用50mmol/L TrisMaLeate彻底冲洗。100g/L硫化铵中显色1min。视网膜铺片，在显微镜下照相。
2结果
2.1间接检眼镜检查
SD大鼠结束高氧后1～3d观察视网膜血管呈现白色，发现所有的幼鼠均可见颞侧周边部视网膜血管呈现毛刷状，无血管网。5d后观察所有的SD幼鼠眼底呈现红色，视网膜血管清晰可见，毛刷状血管已不存在，大部分幼鼠（17/24只）视网膜周边部可见出血，个别可见视盘出血。连续观察10d后几乎所有的幼鼠出血已经吸收。
2.2 SD大鼠视网膜血管ADPase染色
经过高氧环境变化后在正常氧环境下饲养3d行视网膜血管ADPase染色显示：视网膜周边部无血管区(图1)。ROP模型视网膜血管ADPase染色显示：视网膜周边部可见大量血管芽及高密度血管（图2）。
2.3 SD大鼠ROP模型形成率
采用检眼镜观察法和ADPase血管染色法观察ROP模型形成数分别为18（24）只和16（24）只，ROP模型形成率分别为75%和66%。
3讨论
本实验中我们采用自行设计的简易科学合理模型形成装置，形成了ROP模型，减少了费用。而且模型的成型率和国外报道的几乎相同[3]。为以后实验研究提供ROP模型奠定基础。另外，我们采用间接检眼镜观察经过高氧环境下SD幼鼠的视网膜血管的变化。这一方法的应用可以直接观察模型形成的情况能较好为下步实验提供动物模型，它具有一定指导价值。SD幼鼠ROP模型形成率不到70%，用SD鼠的ROP模型作研究时，约有30%的非ROP可能将被认为是ROP模型，这样很可能出现材料假阳性，使实验的可信度降低。我们采用间接检眼镜观察经过高氧环境下幼鼠视网膜血管的变化，可以排除非ROP幼鼠，提高了实验可信度。
可变氧环境下形成ROP模型经过高氧环境，相对低氧环境及正常氧环境3个过程[410]：1)高氧环境阶段:高氧毒性作用抑制血管内皮细胞生长，从而引起血管生长发育迟缓，使部分视网膜组织成为无血管罐注区，刺激视网膜组织VEGF分泌增多，引起血管内皮细胞增殖。当高氧对内皮细胞抑制作用和VEGF刺激血管内皮细胞作用平衡打破时便可引起新生血管的形成。在实验中我们观察经过高氧环境后1～3d SD鼠颞侧周边视网膜血管呈现毛刷状，无血管网，这说明在进入正常氧环境下的最初阶段，氧对血管内皮细胞的抑制作用较强。2)相对低氧环境阶段:已经适应高氧环境的视网膜组织在进入正常室内氧环境时，由于氧相对不足可引起整个视网膜缺氧和无灌注区组织缺氧进一步加剧，刺激视网膜组织VEGF分泌增加引起血管内皮细胞大量增殖。大量的VEGF产生便形成大量新生血管。我们观察在进入正常氧环境第5d视网膜组织颞侧周边部出现血管网，毛刷状血管消失并且发现几乎所有鼠在周边部视网膜有出血灶甚至在视盘周围也发现有出血。此时的视网膜出血则表明有新生血管形成，出血量的大小和出血灶的多少也反映了新生血管量大小。用间接检眼镜观察我们发现模型鼠视网膜出血在10d几乎消失是否说明血管已经消退模型失败？我们继续在室内环境下饲养SD大鼠1mo，每只鼠取1只眼球共24只眼球，进行血管内皮细胞染色，结果显示周边部血管网密度增加、血管扩张、迂曲并发现大量血管芽。检眼镜观察得到的结果要比染色的结果要高的原因也说明形成的模型存在自行消退的现象[11]。出血吸收可能是部分新生血管消退和组织血液循环增强所致。
另外在整个SD大鼠ROP动物模型形成过程中，母鼠和乳鼠死亡也是模型失败的主要原因。我们在实验中发现以下几种因素均可以引起环境失衡而致鼠的死亡归结如下：氧浓度剧变;饲养箱内气压过高;饲养箱内排泄物过多分解大量有害气体;箱内湿度过高。如果上述因素得到较好的解决,SD大鼠ROP模型的形成成功率还是比较高的。另外在本实验中利用间接检眼镜直接观察SD大鼠眼底新生血管的形成方法能够为动物实验提供理想动物模型，此种观察的方法在国内外尚未见报道。
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