兔角膜Fas和Fas配体mRNA的表达和意义
眼科研究 2000年第4期第18卷 实验研究
作者：钟一声 程枫 王康孙
单位：钟一声 王康孙（200025上海第二医科大学瑞金医院眼科中心）；程枫（上海第二医科大学人类基因治疗研究中心）
关键词：Fas；Fas配体；角膜移植；免疫赦免
摘要 目的了解Fas和Fas配体(FasL)mRNA在兔角膜中的表达情况，探讨其在角膜移植中的作用。方法人工合成特异性寡核苷酸探针，应用原位分子杂交方法检测6只新西兰白兔双眼角膜上皮、角膜基质和角膜内皮层Fas和FasL mRNA的表达。结果正常兔角膜上皮和内皮细胞层有Fas mRNA表达，基质中无表达；角膜上皮和内皮细胞层有强FasL mRNA表达，且基质中亦有表达。兔角膜FasL mRNA表达强于Fas mRNA的表达。结论角膜表达Fas和FasL可能与角膜移植存活有关。
分类号 R772
The expression and significance of Fas and Fas ligand mRNA on rabbit corneas
Zhong Yisheng Cheng Feng Wang Kangsun
（Ophthalmic Center，Ruijin Hospital，Shanghai Second Medical University,Shanghai 200025）
Abstract ObjectiveTo investigate the expression distribution of Fas and Fas ligand（FasL） mRNA on rabbit corneas，and evaluate its effect on corneal allograft survival．MethodsBased on the published oligonucleotide sequences of Fas and FasL，two oligonucleotide probes were synthesized．The expression distribution of Fas and FasL mRNA on the corneal epithelium，corneal stroma and corneal endothelium for six New Zealand rabbits were detected with in situ hybridization．ResultsFas mRNA expression was present on the normal corneal epithelium and endothelium，and not present on the normal corneal stroma．FasL mRNA was present intensely on the normal corneal epithelium and endothelium，and also present on the corneal stroma．The capacity for corneal expression of FasL mRNA was higher than that of Fas mRNA．ConclusionFas and FasL expression on cornea may be relative to corneal allograft survival．
Keywords Fas Fasligand corneal allograft immune privilege
角膜移植是机体内成功率最高的器官移植之一，据统计角膜移植1年的成功率可达85%～90％，5年成功率达70%以上［1，2］。目前认为，同种角膜移植的高成功率归功于：前房为免疫赦免区；角膜无血管、无淋巴循环和相对缺乏抗原递呈细胞；存在复杂的免疫抑制因子；低MHC抗原表达和角膜抗原的免疫偏离等。最近研究显示，与细胞凋亡相关的Fas和Fas配体(Fas ligand，FasL)相互作用在机体免疫赦免和免疫耐受过程中具有重要作用［3，4］。鉴于此，我们应用原位分子杂交方法检测兔角膜Fas和FasL mRNA的表达情况，探讨其在角膜移植中的作用和意义。
1 材料与方法
1．1 实验动物 新西兰健康大白兔6只，体重2．5～3．0kg，无眼疾患，雌雄兼用(中国预防医学科学院寄生虫病研究所提供)。将兔静脉麻醉，无菌下摘除眼球，剪下完整角膜，沿角膜中心将角膜一分为二，迅速投入液氮中保存备用。
1．2 Fas和FasL mRNA的检测
1．2．1 试剂：特异性寡核苷酸探针：Fas［5］：5’-GTGATGAAGGACATGGCTTAG-3’；FasL［6］：5’-GCAGATCTTAGTGGAGGCAGTGG-3’。DIG 3’末端寡核苷酸标记试剂盒和显色系统(BM公司)；顺丁烯二酸和鲑鱼精DNA（Sigma公司)。所有试剂均用DEPC水配制。
1．2．2 探针标记和原位杂交：参照BM公司试剂盒说明推荐的方法进行探针标记和原位杂交，将Fas和FasL寡核苷酸探针进行3’-末端标记，标上DIG-11-ddUTP。角膜组织冰冻切片(厚约5～6μm)，干燥后4%多聚甲醛固定15～20min，PBS洗涤后，依次进行预杂交1h，37℃杂交16～18h，洗脱(2×SSC 15min，1×SSC15min，0．5×SSC 37℃ 15min，0．5×SSC 15min)，2%绵羊血清封闭30min，1∶ 1000抗体室温2h，NBT和X-P37℃暗处反应4～5h，HE复染和显微镜观察结果并拍照。阴性对照：杂交液中使用未标记探针。
2 结果
正常兔角膜行Fas和FasL原位杂交，观察其mRNA表达，以上皮细胞和内皮细胞浆及基质中有无蓝紫色杂交颗粒区分阳性和阴性表达，以颗粒着染的浓密程度区分表达强弱。正常兔角膜上皮和内皮细胞层可见有Fas mRNA表达，基质中未见明显Fas表达(图1)；角膜上皮和内皮细胞层有FasL mRNA表达，且基质中亦有轻微表达(图2)。兔角膜中FasL mRNA的表达量大于Fas mRNA的表达量。
图1 正常兔角膜上皮层有Fas mRNA表达，基质中无表达(×400）
Fig．1 Fas mRNA expression was present on the normal corneal epithelium，and not present on the normal corneal stroma（×400）
图2 正常兔角膜上皮和基质中均有FasL mRNA表达(×400）
Fig．2 FasL mRNA was present on the normal corneal epithelium and stroma(×400)
3 讨论
3．1 Fas和FasL的分子生物学特性
最初Trauth和Yonehara分别发现两株可以诱导细胞凋亡的杂交瘤株，并将其产生的单抗分别命名为抗Apo-1和抗Fas单抗。尔后发现Fas和Apo-1蛋白分子具有相同的氨基酸(AA)系列。1993年第五届人白细胞分型会议正式将Fas／Apo-1命名为CD-95分子。人Fas基因组位于染色体10q23上，是全长为25kb的单拷贝基因，包含8个内含子和9个外显子。成熟的Fas蛋白由319个AA组成，相对分子质量约45×103。Fas与肿瘤坏死因子受体(TNFR)属同一家族［5］。Fas属Ⅰ型跨膜糖蛋白，胞外区含157个AA，含2个N-糖基化位点，由此连接多糖成分，跨膜区含17个AA，胞浆区为145个AA，与TNFR-1同源性约近50％，均含60～70个AA保守系列，与细胞死亡有关，称死亡结构域。Fas主要以膜受体形式存在，还可通过转录水平的不同并接产生可溶性Fas分子，对Fas诱导的细胞凋亡有抑制调节作用［7，8］。
1994年Suda等首次纯化出相对分子质量40×103左右的鼠糖蛋白，能与Fas结合，称FasL。FasL的AA系列与Ⅱ型跨膜糖蛋白相近，属肿瘤坏死因子(TNF)家族成员，其N端缺少信号系列，由22个疏水AA构成跨膜区，胞内区则由富含脯氨酸残基的77个AA构成，胞外区由C端199个AA构成，含4个糖基化位点。编码人FasL的基因组约为8．0kb，位于染色体1q23上，由4个外显子和3个内含子构成。FasL分子以膜结合蛋白P40和可溶性蛋白P27形式存在，通常P40以单体形式存在。当FasL与Fas以三聚体形式结合时，可激活胞内Fas死亡信号系列的活性，诱导表达Fas的细胞发生凋亡［7，8］。
3．2 Fas和FasL mRNA在角膜中的表达和意义
角膜组织可组成(constitutive)或经激活诱导表达Fas和／或FasL，Griffith和Stuart等［4，6］应用Northern杂交和RT-PCR方法发现眼组织有FasL mRNA表达，同时应用免疫组化方法发现角膜上皮细胞和内皮细胞有强FasL蛋白表达；他们进一步通过实验发现，角膜感染时侵入眼前房的炎症细胞有Fas阳性表达，并且被局部组织细胞表达的FasL诱导凋亡，从而避免了炎症反应。本实验发现正常兔角膜上皮细胞和内皮细胞均有Fas和FasL mRNA表达，并且角膜基质层亦有轻微FasL mRNA表达，这与Griffith等的结果基本一致。
角膜移植是人体器官组织移植最成功的一种，且角膜被视为具有免疫赦免性的器官之一。最近，有学者提出免疫细胞仍可以进入免疫赦免部位，但它们很快就被这些部位所表达的FasL通过诱导Fas阳性免疫细胞凋亡的机制所消灭［9］。Fas和FasL系统在组织器官移植中的作用越来越受到人们的重视，Bellgrau等［3］将睾丸中FasL表达阳性的Sertoli细胞异位移植到肾包囊中，结果发现细胞存活，无排斥反应发生；Lae等［10］创造性地将异源胰岛细胞和人工构建的由FasL基因转染的同源肌母细胞混合移植于鼠肾包囊中，其存活时间较单纯胰岛细胞移植有显著延长，并且能使糖尿病鼠模型保持长达80天之久的正常血糖水平。这些研究表明Fas和FasL系统能促进组织细胞移植存活和成功。
角膜组织表达Fas和FasL在角膜移植中具有重要意义。Stuart等认为角膜移植的高成功率依赖于角膜移植组织有持续的FasL表达，他们通过鼠角膜移植实验发现，FasL表达阴性的角膜移植片全部发生排斥反应，而Fas表达阴性的小鼠被移植FasL表达阳性的角膜片亦全部发生排斥反应，同时他们观察到FasL表达阳性的角膜片能诱导侵入的淋巴细胞发生凋亡，而FasL表达阴性的角膜片则不能［6］，因而认为移植角膜片持续阳性的FasL表达导致炎症细胞的死亡是同种角膜移植成功的关键因素。角膜移植前进行FasL检测或增加角膜FasL的表达可望估计或提高角膜移植的成功率，其具体作用机制和作用尚待进一步的研究。
参考文献：
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3．Bellgrau D，Gold D，Salawry H，et al．A role for CD95 ligand in preventing graft rejection．Nature，1995，377∶ 630
4．Griffith Ts，Brunner T，Fletcher SM，er al．Fas ligand-induced apoptosis as a mechanism of immune privilege．Science，1995，270∶ 1189
5．Nagata，S,Golstein P．The Fas death factor Science，1995，267∶ 1449
6．Stuart PM，Griffith TS，Usui N,et al．CD95 ligand（FasL）-induced apoptosis is necessary for corneal allograft survivgal．J Clin Invest，1997，99∶ 396
7．张桦．Fas／FasL与移植免疫．国外医学*免疫学分册，1998，21∶ 130
8．高勇，张登海．Fas系统与肿瘤免疫逃避．国外医学·肿瘤学分册，1998，25∶ 327
9．Griffith TS，Yu X，Herndon JM，et al．CD95-induced apoptosis of lymphocytes in an immune privileged site induces immunological tolerance．Immunity，1996，5∶ 7
10．Lau HT，Yu M，Fontana A，et al．Prevention of islet allograft rejection with engineered myoblasts expressing FasL in mice．Science，1996，273∶ 109 |
