【摘要】 真菌性角膜炎是20世纪50年代发展起来的一种危害较大的疾病，若诊断及治疗不及时，将会导致角膜穿孔、失明，更严重的要行眼球摘除术。随着真菌性角膜炎发病率的升高，人们对其有了更进一步的认识，本文对真菌性角膜炎的基础及临床研究作一综述。
【关键词】 角膜炎 真菌 早期诊断 PCR
0引言
真菌性角膜炎（fungal keratitis,FK）于1879年由Leber首先报道。20世纪50年代以后，由于激素、抗生素的广泛应用，角膜接触镜使用增多，以及人们对本病诊断和治疗水平的提高，使真菌性角膜炎的发病率逐年上升［1］。近10年来，真菌性角膜炎的发病率在我国明显升高，主要与广泛应用广谱抗菌素及皮质类固醇激素，或长期佩戴角膜接触镜和应用免疫抑制剂有关[2,3]。真菌是一种条件致病菌，在我国，外伤仍然是真菌性角膜炎的首位致病因素，植物性外伤导致发病失明的病例数逐年增加[4]，最近的研究资料使人们对该病的病原体种类、动物模型、病理基础、发病机制、临床特征、诊断方法、治疗手段等方面的认识均发生了很大的变化，本文对上述进展综述如下。
1真菌性角膜炎的病原体和易感因素
迄今发现有70多种真菌可引起角膜感染[5]。引起角膜感染的主要真菌菌种在不同地区差别较大。发达地区及气候较寒冷地区（如美国北部和英国）的最常见致病菌种为白色念珠菌（31.6%～48.8%）；发展中国家及气候温暖或炎热地区（如美国南佛罗里达州、印度、尼日利亚等）主要是镰刀菌和曲霉菌(曲霉菌12%～47%，镰刀菌16%～62%)，在我国广东、河南、河北及山东地区调查显示真菌性角膜炎致病菌种以镰刀菌和曲霉菌为主，其中大部分地区镰刀菌是首位致病因菌，占28%～65%；其次是曲霉菌，占11%～49%；第3～4位分别是青霉属（3.6%～11.6%）和弯孢菌属（1.2%～13.1%）［69］。
正常人结膜囊真菌培养阳性率为2%～25%，正常情况下不致眼病，但一定条件下如外伤、长期应用抗生素而致菌群失调或应用激素、免疫抑制剂而免疫力低下时，外源或内源真菌眼部繁殖致病。Schwab［10］认为丝状真菌性角膜炎多发于健康人，其易感因素为外伤，特别是植物性外伤，局部应用激素能提高发病的可能性，但不是必须的；白色念珠菌性角膜炎的主要易感因素是长期的角膜上皮溃疡。穿透性角膜移植术、佩戴治疗性软性接触镜、局部应用激素促进了真菌的增殖。
2真菌性角膜炎的病理
组织病理学特征分析：不同真菌其自身的感染特征和生长方式因致病真菌与角膜的粘附不同，对角膜组织的损害也不同，其共同特点为真菌对角膜组织的直接破坏作用、角膜组织内大量中性粒细胞的浸润。真菌（镰刀菌）释放磷脂酶A和溶血磷脂酶破坏宿主细胞膜的溶血脂酶，使得角膜组织常为凝固性坏死，构成真菌性角膜感染特有的病理学改变。炎症细胞在前房内积聚，形成前房积脓。推测造成FK的前房积脓并非真菌直接侵犯的结果，可能是真菌的毒素刺激葡萄膜的无菌性炎症反应。角膜真菌病主要病理变化是广泛的化脓性炎症，大量中性粒细胞浸润，角膜基质层的凝固性坏死及胶原纤维肿胀，病灶附近可见分离的小脓肿形成，病程晚期可见多形核白细胞环绕真菌形成肉芽肿性反应。
3真菌性角膜炎的发病机制
真菌性角膜炎的发病机制可归纳为以下4点：（1）真菌对角膜组织的直接破坏及毒素作用；（2）中性粒细胞酶的破坏作用；（3）免疫因素：在病变过程中，真菌及毒素或变性角膜组织刺激机体产生抗体，抗原抗体复合物沉积于角膜组织，致使中性粒细胞积聚与真菌一起酿成真菌角膜病变；（4）免疫力降低，尤其是细胞免疫功能降低，可能促成角膜真菌病发生发展的重要因素。
4真菌性角膜炎的分型
真菌性角膜炎的科学分型有利于指导临床治疗及判断预后，最理想的是按感染菌种分型［11,12］。按角膜损害形态和发展过程分为：（1）浅在型:病灶位于角膜中央或旁中央，刺激症状轻，眼疼不著，病灶区有菌丝苔被呈损害性隆起，早期即可出现后壁皱褶和角膜后沉着物（KP），可伴有前房积脓，角膜病损亦可呈束状、蚕食状、树枝状等多样形态，表现较温和，病程可达数周及数月，对药物治疗反应较敏感；（2）深在型：累及深层，症状可急骤，有的呈匍行性溃疡外观，可由粥样KP及粘稠的前房积脓，虹膜炎反应较重，易于出现角膜穿孔。按致病菌种分：（1）丝状霉菌性角膜炎：包括镰刀菌、曲霉菌、头孢菌、青霉菌等，其中以镰刀菌及曲霉菌感染最常见，镰刀菌所致角膜溃疡症状重，破坏性强，可致角膜穿孔；（2）酵母菌性角膜溃疡，包括白色念珠菌等，多为条件致病菌，溃疡浅，病程长，较少穿孔。按真菌在角膜组织中的生长方式分：（1）表层（水平生长）型：真菌为表层地毯式生长，对真菌药物效果好，刮片阳性率高，是板层角膜移植的适应证；（2）局灶（板层）生长型：病灶较局限，真菌能垂直和斜行生长，抗真菌药物因穿透性差，疗效不佳，行穿透性角膜移植效果好；（3）弥散（垂直和斜行生长）型：多为临床较严重的真菌感染，有特异的真菌感染伪足、卫星灶等，抗真菌药物往往无效，是板层移植的禁忌证。
5真菌性角膜炎的动物模型
5.1理想的动物模型的要素
理想的动物模型应尽可能模拟人角膜自然感染的方式，须具备以下要素［13］：（1）感染的初始化过程应近似人角膜真菌感染的方式；（2）无需对宿主进行免疫学操作；（3）在感染的菌丝阶段，应当排除真菌的侵袭性成分；（4）应有客观的观测方法来量化感染后的病变。
5.2实验动物的选择
FK发生于马、狗、爬行动物等均较少见。常见真菌研究中使用的动物多为小动物，如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、犬和猫等，小鼠和豚鼠能满足绝大多数真菌接种的需要，而小鼠是真菌病动物模型中最常用的一种动物［14］，但小鼠的角膜很小，进行手术操作时困难，感染后可取材的标本少，而且不利于真菌感染大体形态学的观察，所以，大部分研究者在进行眼部真菌感染研究中，最常应用的实验动物是兔，兔角膜较人角膜大，易对其进行操作和观察，可获得较多的实验标本［15］。
5.3菌种的选择
应选择临床常见的菌种，以便研究结果能应用于临床，为保证实验结果的可重复性和可靠性，尽可能选用权威微生物种保存机构（如American Tissue Culture Collection,ATCC,中国科学院微生物研究所等）保存的标准菌株，而且最佳者为分离自临床真菌性角膜炎患者的标本。适合我国国情的菌种有镰刀菌、曲霉菌、念珠菌。
5.4接种方法
采用合适的方法将菌种接种至动物角膜是建立动物模型最关键的步骤，模仿人的感染过程当然是最合适的，但查阅近10年的文献，未发现有通过角膜划痕法建立浅层真菌性角膜炎的报道。目前常用的接种方法有：（1）角膜基质注射法：此法使用带28或30号针头的0.5mL胰岛素注射器将0.05mL预制真菌液注入动物角膜基质层内，但这种方法破坏了角膜的正常结构，仅用于FK的药物疗效和诊断方法，不适于研究真菌感染角膜的发病机制、发生发展的过程及感染组织病理学的研究；（2）角膜接触镜法［13］：接种前，完整刮除兔角膜中央直径约7mm范围的上皮，然后覆盖上软性角膜接触镜，在接触镜及角膜层间注入0.1mL白色念珠菌菌液（浓度1010CFU/mL）后暂时性缝合眼睑，24h后打开睑裂并去处角膜接触镜，此法近似人角膜感染的病程，感染成功率高，现已应用于念珠菌性角膜炎的组织病理学研究［16］，但对发展中国家的最常见的镰刀菌属缺乏相关研究；（3）角膜表面镜片术法：曾庆延等［17］利用角膜镜片术制作真菌自表面感染的动物模型：刮除角膜中央部分上皮（约6mm）后，将预制的异体全厚角膜植片（甘油冷冻保存）缝在动物角膜表面，层间注入一定量的真菌菌液，接种后24h移去角膜植片，此法感染成功率高，可重复性好，但操作相对复杂，对实验者的手术技术水平有一定的要求；（4）针刺法［18］：接种前预先用皮质类固醇或免疫抑制剂处理实验动物（分别于接种前5，1d im 100mg/kg甲强龙，或者分别于接种前5，3，1d im 180mg/kg环磷酰胺）造成免疫低下的动物模型，然后用皮下针头在角膜表面以格子状交叉刺成浅表创伤，表面涂0.005mL预制真菌菌液（含真菌孢子102～108CFU/mL）闭合动物眼睑几秒钟使菌液均匀分布于角膜表面，此法也是预先造成动物机体免疫功能低下，而临床中大部分真菌性角膜炎患者发病时并非处于免疫抑制状态，所以，此法不同于人的自然感染病程，不适于感染的发生、发展及其机制的研究。
5.5各类实验性真菌性角膜炎的表现特点［19,20］
茄病镰刀菌性角膜炎：早期（接种3d后）显示毛玻璃样改变，菌丝灶明显，随病程延长，毛玻璃样病变逐渐增厚，呈现表面隆起的干燥灰白色病灶，病灶周围浸润不明显。烟曲霉菌性角膜炎：角膜病变显示徽章样改变，周边病变浓密而中央稍淡，可见免疫环，病情发展迅速，3d后出现前房积脓，脓液粘稠不显液平，角膜病变迅速扩大。对其病变色泽不同学者有不同描述，有黄绿色、灰白色、黄白色，有时伴有虹膜炎；感染后的3～7d为感染的高峰期，10～12d后角膜开始血管化。白色念珠菌性角膜炎：在真菌接种后24h，感染的兔眼出现大量白色分泌物，角膜感染区可见白色浸润及轻度水肿，显示浅层病变，轻度隆起，病情发展缓慢，病变由半透明到灰白色，可见伪足和卫星灶。刘敬［19］报道病变周围有明显的白色浸润，而易先金等［20］报道未发现病灶外周之反应环，前房积脓粘稠，液面常高低不平呈丘状。实验性念珠菌性角膜炎多于2～3wk有自愈倾向。
6真菌性角膜炎的实验室诊断
随着真菌性角膜炎发病率的上升，以及其致盲率高的特点，使得FK的诊断成为当前迫切解决的问题，而治疗成功与否及视力恢复的程度则取决于早期、快速、正确的诊断。虽然临床症状有助于诊断，但是可靠、准确的诊断必须依靠实验室技术。实验室诊断方法主要有以下几种。
6.1角膜刮片镜检
这种方法是目前最有价值的快速诊断方法。10%～20% KOH湿片法:取材后涂片，滴上KOH溶液，在光镜下观察，发现菌丝则为阳性。因KOH溶解非真菌杂质而显示菌丝，此法的检出率为33%，10%KOH和墨汁以9∶1的比例混合而成的混合液，盖上盖玻片，放入湿盒中，分别在3，18，24h镜检［21］，墨汁KOH染色后1h镜检，难以发现真菌，并且很难将菌丝和胶原纤维区分开来，但在18～20h后尤其是在菌量多、涂片薄的情况下，检出率大为提高。真菌的染色方法很多，主要为革兰氏染色（Gram）、吉姆萨染色（Gimsa）染色，两种方法的检出率分别为55％和66％，此外还有过碘酸雪夫氏染色（PAS）果莫里六胺银染色（GMS）染色法，此法的阳性率为85％。近来有人采用荧光显微镜检查，所用荧光染色法有二苯乙烯荧光增白剂（CFW），还有荧光标记的凝集素（FCLS）。
6.2角膜刮片培养
真菌培养阳性是真菌性角膜溃疡诊断的金标准，不仅可以鉴定菌种，还可做药敏试验。大多数角膜感染的真菌3d即能生长，部分为5～7d，约1/4真菌需2wk以上时间才能生长，因此，真菌培养基应保存3wk［22］。用于真菌培养的培养基有Sabouraud培养基、脑心浸出液培养基、血液琼脂糖平板培养基、巧克力琼脂糖平板培养基。Sabouraud培养基是最敏感的眼部真菌分离培养基，阳性率为52%～79%。由于各种培养基各有优缺点，学者们建议多种培养基联合培养以提高检出率。但真菌培养需时长，不利于早期诊断及指导临床治疗，而且存在杂菌污染问题。
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