大鼠视网膜缓慢变性／盘膜边缘蛋白基因的克隆

　　中华眼底病杂志 1999年第2期第15卷 论著

　　作者：高玲　严密　陈大年　罗成仁

　　单位：610041 成都，华西医科大学附属第一医院眼科

　　关键词： 视网膜变性；基因扩增；序列分析；动物，实验；聚合酶链反应

　　【摘要】　目的　克隆大鼠视网膜缓慢变性／盘膜边缘蛋白(retinal degeneration slow／peripherin，RDS/peripherin)　基因。　

　　方法　以SD大鼠的视网膜polyA+RNA为模版，采用RT-PCR的方法扩增一段约1　555　bp的cDNA片段，并亚克隆至pBluescriptⅡKS(+)载体中，进行限制性内切酶酶切和序列分析。　

　　结果　证实所克隆的片段是大鼠的RDS/peripherin　cDNA，与Begy等报道的序列［1］相比，除3′端非翻译区的第1　242位的碱基A→G，第1　409～1　411位碱基CA→CCA外，其它序列基本一致［1］。　

　　结论　已获得大鼠RDS/peripherin基因的cDNA，为研究RDS/peripherin基因的功能及在视网膜变性疾病中的作用奠定实验基础。

　　中国图书资料分类法分类号　R774．13　R730．43　R392．11

　　Cloning of rat RDS/peripherin　gene

　　GAO Ling,YAN Mi,CHEN Danian,et al.Department of Ophthalmology,The First ClinicalMedical College,West China University of Medical Sciences,Chengdu 610041,China

　　【Abstract】　Objective　Molecular cloning of rat retinal degeneration slow(RDS)gene cDNA.　

　　Methods　Using Poly　A+　RNA from retina of SD rat as template,a 1　555bp positive cDNA band was obtained by RT-PCR and subcloned into pBluescriptⅡKS(+)　vector.The cloned fragment was analyzed with restriction endonucleases and sequencing.　

　　Results　It had been proved that the cloned fragment was rat RDS/peripherin cDNA.Except for the substitute of A1　242G and CA　1409-1　411CCA,the other sequences corresponded to that　reported by Begy.　

　　Conclusion　Rat RDS／peripherin cDNA was obtained.Researches on function of rat RDS／peripherin　gene and its role in retinal degeneration are under way.

　　【Key words】　Retinal degeneration　　Polymerase chain reaction　　Animals,laboratory　　Gene amplification　　Sequence analysis

　　盘膜边缘蛋白(peripherin)在促进光感受器细胞外节盘膜的形成和稳定方面起着重要作用［2］。编码盘膜边缘蛋白的RDS基因突变可导致多种视网膜变性疾病，但致病机制尚不清楚［3］。为了进一步研究该基因的功能和可能的致病机制，我们用RT-PCR的方法克隆大鼠的RDS/peripherin基因，使之能用于RDS/peripherin基因的表达和功能研究。

　　1　材料和方法

　　1.1　酶及特殊试剂　SuperscriptTM预扩增cDNA第一链合成系统(Gibco　brl公司)、ExpandTM High fidelity PCR system、EcoRⅠ、SalⅠ、PstⅠ、ScaⅠ(Boehringer公司)；大鼠视网膜polyA+RNA(Clontech公司)；λDNA/HindⅢ和PCR分子量标准、大肠杆菌JM109、T4　DNA连接酶(华美生物制品公司)；Wizard DNA clean-up　kit、Wizard Plus Miniprep Pu-rification kit(Promega公司)；载体pBluescriptⅡKS(+)(华西医科大学遗传室)。

　　1.2　PCR引物设计及合成　参照Begy等［1］报道的大鼠RDS/peripherin　cDNA的全序列，设计并合成了5′端引物和3′端引物。其中5′端引物长度为26bp，引入了一个EcoRⅠ识别位点。3′端引物长度为33bp，引入了一个SalⅠ识别位点。5′端引物：TTTG↓EcoRIAATTCACTCCCTGCAGCTTGGGC；3′端引物：TTTG↓SalⅠTCGACCTTGATTTTATGTGTCAAAT-AATG，由GIBCO公司合成。

　　1.3　逆转录PCR扩增目的片段　按GIBCO公司提供的试剂盒使用说明书进行cDNA第一链合成：反应体系20μl，其中含Oligo(dT)lμl、大鼠视网膜polyA+RNA100μg。反应条件：42℃水浴50min，70℃水浴15min终止反应。

　　PCR扩增：总体积50μl，其中逆转录产物4μl、上下游引物各2μl(40pmol)、High fidelity PCR system4.2U，置PTC200热循环仪中进行标准PCR反应。循环参数设定为：94　℃1min、52℃1min、72℃1min。28个循环后72℃延伸7min。取8μlPCR产物在2%琼脂糖凝胶上电泳。

　　1.4　目的片段的克隆及测序［4］　PCR产物经EcoRⅠ、SalⅠ酶切，采用Wizard DNA clean-up kit和低熔点琼脂糖回收目的片段，与pBluescriptⅡKS(+)载体的EcoRⅠ、SalⅠ酶切片段连接，转化JM109感受态细胞，筛选重组质粒。重组质粒经Wizard Plus Miniprep Purification kit纯化后，利用pBluescript Ⅱ KS(+)的通用引物(T7和T3　promotor primer)，采用Sanger双脱氧链终止法对克隆的cDNA序列进行分析(赛百盛公司)。

　　2　结果

　　2.1　PCR扩增的结果和鉴定　取8　μl　PCR产物在2%琼脂糖凝胶电泳，以PCR分子量标准为参照(图1)，大约于1.5　kb处有一条DNA条带，与预期的长度(1　555　bp)相符。

　　2.2　克隆结果　筛选的克隆经EcoRⅠ+SalⅠ双酶切证实：扩增片段已插入到pBluescriptⅡKS(+)载体中(图2)。EcoRⅠ+PstⅠ、EcoRⅠ+ScaⅠ酶切后分别产生1.1　kb+3.4　kb、500　bp+1.1　kb+2.9　kb，与预期的长度相符(图3)，提示我们克隆的DNA片段是大鼠的RDS/peripherin　cDNA。

　　2.3　测序结果　序列分析结果表明克隆基因长度为1　555bp。与Begy等报道的序列相对比［1］，证实克隆的基因包含了大鼠RDS/peripherin　cDNA的5′端非翻译区和编码区的全部序列、3′端非翻译序列。根据序列分析结果，整理出克隆的SD大鼠RDS/peripherin　cDNA的序列(图4)。

　　图1　RT-PCR扩增产物的电泳检测：PCRmarker(M)、1：扩增的PCR产物　图2　目的片段的酶切分析。M1：λDNA/HindⅢ分子量标记、1-5：EcoRⅠ+SalⅠ双酶切、M2：PCR分子量标准　图3　重组质粒pBluescript-RDS限制性内切酶酶切分析：M1：λ DNA/Hind Ⅲ 分子量标记、1：EcoRⅠ+ScaⅠ双酶切、2：EcoRⅠ+PstⅠ双酶切、3：EcoRⅠ+SalⅠ双酶切、M2：PCR分子量标记　Fig.1　RT-PCR products of RDS cDNA.M1:PCR markers、lane 1:the PCR produts　Fig.2　Identification of amplified segment.M1:λDNA/Hind Ⅲ marker、lanel-5:EcorⅠ+SalⅠ digested、M2:PCR markers　Fig.3　Restriction analysis of recombinant plasmid pBluescript-RDS.M1:λ DNA/Hind Ⅲ markers、lane 1:EcoRⅠ+ScaⅠ digested pBluescript-RDS plasmid、lane 2:EcoRⅠ+Pst I digested pBluescript-RDS plasmid、lane 3:EcoRⅠ+Sal Ⅰ digested pBluescript-RDS plasmid、m2:PCR markers

[1] [2] 下一页