作者：徐西彬，陈耀星，王子旭，董玉兰，曹 静，刘妍妍

　　【摘要】  目的：为视网膜神经节细胞（retina ganglion cell，RGC）的准确定量研究提供形态学的指标依据。

　　方法：联合应用Nissl染色法和神经元逆行标记技术，并通过计算机图像处理技术测定RGC的形态分布特征。

　　结果：两种标记方法在视网膜组织中标记的细胞形态、大小和密度分布呈现明显的差异。Nissl染色可以使所有细胞着色，神经元逆行标记技术仅使RGC着色。通过两者的综合分析，在RGC等密度曲线图中可以观察到在视神经乳头下方形成一个沿鼻颞侧轴方向伸展的高密度区，即视条纹，由视条纹至周边部细胞密度递减。

　　结论：联合应用视网膜铺片法和神经元逆行标记技术两者的优点，能够较准确地测定RGC的密度、大小及其分布等形态特征。

　　【关键词】  视网膜铺片；神经节细胞；分布；细胞密度；细胞大小

　　Determination of density distribution in retina ganglion cell using methods of retinal preparation and retrograde cell labeling of carbocyanine dye

　　Xi-Bin Xu, Yao-Xing Chen, Zi-Xu Wang, Yu-Lan Dong, Jing Cao,Yan-Yan Liu

　　Foundation items: New Century Excellent Talents in University(No.NCET-04-0126) and Specialized Research Fund for the Doctoral Program of Higher Education(No.2004019002) and Beijing Natural Science Foundation(No.6032014)

　　College of Veterinary Medicine，China Agricultural University，Beijing 100094，China

　　Abstract AIM: To provide the functional status for the quantitative studies of retinal ganglion cell (RGC). METHODS: The combined methods of Nissl staining, retrograde labeling of carbocyanine dye and image analysis by a computer were used.  RESULTS: The total cells in the ganglion cell layer were stained in Nissl retinal preparation, while only RGC were labeled in DiI-labeled preparation. From the analysis of Nissl staining and retrograde labeling of carbocyanine dye, a horizontal region of high-density (visual streak) was found in the central retina below the optic disk. The cell density decreased from the visual streak to the peripheral zone.  CONCLUSION: The combined methods can be characterized the size and density distribution of ganglion cells in the ganglion cell layer.

　　· KEYWORDS: retinal preparation; ganglion cells; distribution; cell density; cell size

　　0前言

　　在青光眼动物实验和其他有关视神经的损伤和保护研究中，常常需要对视网膜神经节细胞（retina ganglion cell，RGC）进行精确定量作为实验指标[1]。以往对RGC的定量研究多采用单一染色法，例如Nissl染色法、神经元逆行标记法和免疫标记法等[2, 3]。采用Nissl染色法能够同时标记RGC和移位性无长突细胞（dAC）等，传统的判定标准是通过细胞的大小、形状规则及核染色深浅等来区别这两种细胞。但是在实际试验制作的Nissl染色视网膜铺片标本上很难区别节细胞层中的dAC和小的RGC。逆行标记技术可逆行追踪到RGC的胞体，但这种方法并不能标记所有的RGC，因此对RGC的定量计数带来一定的偏差。免疫标记法可特异性的对RGC进行标记，但其背景荧光染色将会干扰视网膜节细胞层的确定和检测，同样会引起定量误差[1]。我们通过Nissl染色结合荧光染料DiI（1,1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetramethyl-indocarbocyanine perchlorate；Molecular probes）逆行标记技术，并借助计算机图像处理软件，对新生犊牛RGC的数量、密度、大小和分布等形态特征进行了系统研究，希望得到更加准确定量检测动物RGC的方法，以期为动物的视觉特征及其形成机制提供可靠的基础性资料，同时对于视网膜疾病防治的研究有着重要的意义。

　　1材料和方法

　　1.1材料 1d龄（P1）黑白花犊牛（购自北京三元绿荷奶牛养殖场）各4头，经颈动脉放血处死后，立即将备用眼球完整取出。剪掉角膜，除去晶状体和玻璃体等物质，每组日龄动物的4只眼球分离视网膜色素层后，置入4g/L的甲醛溶液中固定2～4h后，再将视网膜置换到40g/L甲醛中固定48h以上。其余的眼球放在40g/L多聚甲醛缓冲液中。

　　1.2方法

　　1.2.1视网膜铺片Nissl染色 剥离视网膜，逐渐减去眼球壁，使视网膜完整剥下，然后在涂有明胶的载玻片上将视网膜展平，视网膜节细胞层在上面，边缘剪几个缺口，用毛笔协助视网膜充分展平。在展平的视网膜上一次盖一层光滑硬纸和两层滤纸，最上层再用一载玻片盖住，最后用细线捆住。之后将上述铺片浸入150g/L中性甲醛-纯乙醇（1∶9）溶液中固定24h。除去视网膜上面的几层物质，此时视网膜牢固的贴在载玻片上，再将视网膜铺片浸入50mL/L醋酸－纯乙醇溶液中约1～2h后，用蒸馏水冲洗 2min，1g/L克紫溶液20min（视取材动物和视网膜大小而定）→蒸馏水（2min）→500mL/L乙醇（2min）→700mL/L乙醇（2min）→850mL/L乙醇（2min）→950mL/L乙醇（2min）→1 000mL/L乙醇（5min）→1 000mL/L乙醇（5min）→二甲苯（5min）→二甲苯（5min）→中性树胶封片。用40倍物镜进行显微照相，各测量100个点的单位面积，再将每张底片放大5倍图像描于复印纸上。用计算机进行图象分析(Scion Image软件)。根据结果绘出视网膜的细胞密度分布图，然后参照每一细胞密度级和其所占视网膜面积计算出节细胞的细胞总数和平均密度。

　　1.2.2神经元逆行标记技术 在解剖显微镜下，用细小镊子将carbocyanine dye（DiI）颗粒植入视神经断端。然后将连有眼球壁的视网膜浸入40g/L多聚甲醛磷酸缓冲液（0.1mol/L，pH7.4）中，在37℃的温箱中孵育10mo。然后用眼科手术剪和镊子小心将视网膜完整的剥离出来，然后在载玻片将视网膜展平，滴加荧光封片剂，用盖玻片盖好。视网膜铺片置荧光显微镜（Olympus，BX51）对标记良好的细胞进行显微照相，用Scion Image计算视网膜节细胞的胞体大小。

　　在Nissl染色和DiI标记的视网膜铺片标本的不同部位（视条纹、鼻侧周边部、颞侧周边部、腹侧周边部和背侧周边部）各取相应的点，然后在Microsoft Excel 2003使用工具里的数据分析，对不同部位的数据进行分析并做细胞直方图，然后用Photoshop7.0图像软件进行图像合成。将两种方法的细胞直方图进行比较后，确定视网膜节细胞层的RGC大小。在视网膜铺片标本上将同一细胞密度级的点连线，汇成RGC等密度曲线图。

　　2结果

　　2.1视网膜铺片染色结果 在Nissl染色的铺片标本上的视网膜节细胞层中，能够同时观察到RGC和dAC（图1A，B，C），细胞大小不一，有圆形、椭圆形和多角形等。RGC胞体较大，胞质内充满Nissl小颗粒，核染色浅，核仁明显；而dAC胞体相对较小，多呈圆形或卵圆形，胞质较少，细胞核染色较深。因此大的RGC和dAC很容易区分，但是小的RGC和dAC则相对较难区分。视网膜节细胞层细胞在视网膜中央区的密度最高，为5 462个/mm2。而视网膜周边部细胞密度较低，尤以颞侧周边部降低的最为明显（2 581个/mm2）。

　　2.2神经元逆行标记技术染色结果 神经元逆行标记技术显示，细胞胞体形态多样，呈圆形、椭圆形或多角形等（图 1D）。细胞内荧光明亮，个别细胞可见有荧光充盈的细胞突起。随标记时间的增长，细胞突触内染色增多，部分突起清晰可见。和Nissl染色的节细胞层细胞胞体相比，神经元逆行标记技术的胞体面积平均大小比明显增大（图 1A，B，C）。视网膜周边部细胞较为稀疏，而且在视网膜不同区域，细胞大小不均，视网膜中央区以小细胞为主（152.9±58.6μm 2），而周边部细胞较大（251.9±131.9μm2）。

　　2.3 Nissl染色和DiI标记细胞直方图比较 在Nissl染色节细胞层细胞直方图（图2A）中，细胞大小大多在100μm2以下，仅有少量细胞的胞体大于100μm2，主要集中在 5～30μm2，而在视网膜周边部，尤其在颞侧周边部，虽然细胞也是以小细胞为主，但是大细胞的比例相对增加，有些细胞的胞体大于100μm2，这表明视网膜节细胞层细胞可能有两类细胞组成，由占多数的小型细胞和少数胞体相对较大的细胞组成。在DiI标记RGC直方图中（图2B），我们发现它和节细胞层细胞的胞体范围有明显的差异，DiI标记RGC的细胞范围明显要大于节细胞层的细胞。在视条纹，细胞小于30μm2的细胞很少，细胞范围主要集中在35～200μm2，而在视网膜颞侧周边部，细胞面积增大，细胞范围主要集中在80～300μm2。

　　2.4 RGC大小和密度分布 通过用Nissl染色的有关数据和荧光染料DiI标记的进行对比，并通过直方图来确定新生犊牛视网膜节细胞层中细胞面积大于30.0μm2的为节细胞。对上述细胞进行了统计，其他的细胞则被认为是非节细胞，予以排除。RGC的密度分布不均，在视神经下方沿鼻颞侧轴形成高密度的视条纹（2 608个/mm2）（图3），由视条纹至周边部，细胞密度逐渐降低，尤其颞侧周边部最低（271个/mm2）。而在视网膜的不同部位，细胞大小不均，随视网膜位置而异(图2C)。比较视网膜视条纹与周边部，细胞大小差异明显（P <0.05）。在视网膜视条纹以小细胞为主，平均胞体面积为85.7±29.0μm2；而视网膜周边部的细胞面积大，尤其是视网膜颞侧周边部的细胞面积为241.3±107.6μm2。

　　图3 新生犊牛视网膜节细胞等密度曲线 T：视网膜颞侧周边部；N：鼻侧周边部；D：背侧周边部；V：腹侧周边部；★：视神经乳头。图中数据表示细胞密度（cells/mm2）。图中显示从视网膜视条纹至周边部细胞密度逐渐降低。(scale=10mm)

　　3讨论

　　视网膜铺片技术难度比较大，视网膜组织比较薄，而且附着在色素层上，因此在剥离过程中很容易破碎，从而对实验数据的准确性造成很大的影响。同时视网膜一旦脱离眼球，就很难通过眼观来对视网膜进行准确定位，因此我们对视网膜剥离、展片及其定位等进行了改进。在剥离眼球之前，先在视网膜鼻侧剪一个小口，作为视网膜定位的标志。然后用小镊子向下轻压眼球以裸露视神经，剪断视神经取出眼球。在将眼球完整取出后，剪去角膜，将晶状体、玻璃体等物质轻轻拽出，分离视网膜色素层，再将视网膜置入甲醛溶液中固定。固定是标本制作成功的基础，为了使标本收到良好的效果，我们首先将标本放在4g/L甲醛中2～4h，这样能使视网膜从色素层上脱离出来，使视网膜剥离操作更加容易简单。等视网膜从色素层脱离后再将标本放在40g/L甲醛中固定48h以上，保证标本固定完全，固定效果好。

　　脊椎动物视网膜为细胞体和纤维相间交错排列的多层结构，节细胞层除了含有视网膜节细胞RGC外，还含有移位性无长突细胞dAC。因此，单纯采用Nissl染色法，在节细胞层能够同时观察到RGC和dAC。传统的判定标准是通过细胞的大小、形状规则及核染色深浅等来区别这两种细胞[4]。但是，在实际实验制作的Nissl染色视网膜铺片标本上很难区别节细胞层中的dAC和小的RGC。根据RGC是视网膜节细胞层的唯一传出神经元，其轴突构成视神经的特性，通过视神经植入荧光染料DiI，DiI能与神经轴突和树突膜上的脂质结合，沿神经纤维逆行追踪到RGC胞体，在荧光显微镜下可观察到胞体，而节细胞层其它细胞不显色。但DiI不能将全部RGC标记，因而必须将Nissl染色和DiI法结合，兼取二者优点，使计数快，又能提供形态学研究标本，从而测定RGC的数量、密度大小及其分布。

　　在对视网膜节细胞形态分布的研究中,我们选择视网膜铺片和神经元逆行标记技术两种方法联合应用,并参照视网膜节细胞层细胞直方图,可以对神经节细胞的数量、密度、大小及其分布进行较准确的统计。RGC密度上的差异对视网膜的中枢联系具有重要意义，视网膜上各处RGC的密度决定其投射到脑的信息量。研究动物RGC密度分布，可根据等密度曲线图在脑上标出视网膜投射的局部图，从而进一步研究其传递光信息的不同生理功能，并且可以比较分析动物在进化上的亲缘关系，为阐明动物视觉机理和丰富视觉神经生理学提供基础资料[5]。

　　【参考文献】

　　1 段宣初,卿国平,李婵.实验动物视网膜神经节细胞的定量研究方法.国际眼科杂志,2006;6(3):667-670

　　2 Chen Y, Naito J. A quantitative analysis of cells in the ganglion cell layer of the chick retina. Brain Behav Evol , 1999;53(2):75-86

　　3 Garc?觃 M, Ederra JR, Barb?觃chano HH, Vecino E. Topography of pig retinal ganglion cells. J Comp Neurol , 2005;486(4):361-372

　　4 Wong ROL, Hughes A. The morphology, number and distribution of a large population of confirmed displaced amacrine cells in the adult cat retina. J Comp Neurol ,1987;255(2):159-177

　　5马云飞,陈耀星,王子旭,额尔敦木图,贾六军.北京鸭视网膜节细胞的大小、密度和分布.动物学报,2005;51(4):697-702