作者：陈梅珠，惠延年 作者单位：（710032）中国陕西省西安市，第四军医大学西京医院眼科
【摘要】 目的：探讨人类白细胞抗原 (human leucocyte antigen，HLA)氨基酸残基配型在角膜移植排斥反应中的作用程度，以及术前进行HLA配型的临床意义。
方法：角膜移植患者91例92 眼，其中高危角膜50例50 眼，非高危角膜 41例42 眼。HLA-Ⅰ,Ⅱ类抗原分别由一步单抗法和DNA法检测。根据HLA氨基酸残基的相配数分为HLA的低错配组（2错配、3错配）和高错配组（4错配、5错配）。
结果：高危组的排斥反应率74.0%明显高于非高危组31.0% (P =0.001)。在高危组中，HLA高错配的排斥反应率高达84.8%，明显高于低错配的52.9% ( P =0.021)，而且高错配组发生排斥反应的危险性是低错配组的1.6倍(RR = 1.6 )。在非高危组中：HLA高错配的排斥反应率30.4%与低错配的31.6%比较无统计学意义（P =0.936）。
结论：高危角膜患者HLA高错配组的排斥反应率高于低错配组，术前进行HLA配型有临床指导意义，而对非高危角膜配型无意义。
【关键词】 人类白细胞抗原HLA；氨基酸残基配型；角膜移植
Clinical application of HLA amino acid residue matching in choice of donor and recipient before keratoplasty
Mei-Zhu Chen, Yan-Nian Hui
Department of Ophthalmology, Xijing Hospital, the Fourth Military Medical University, Xi'an 710032, Shaanxi Province, China
Abstract AIM: To evaluate the importance of human leucocyte antigen (HLA) amino acid residue matching in keratoplasty before corneal transplantation. METHODS: There were 92 recipient eyes in 92 cases divided into high-risk (50 eyes) and low-risk (42 eyes) groups according to the degree of neovascularization or corneal ulcer with no response to treatment. The cases were subdivided into two groups: high-mismatching (MM) group composed of 4 MM and 5 MM and low-MM group composed of 2 MM and 3MM. HLA-Ⅰ, HLA-Ⅱwere typed by monoclonial antibody and DNA-based method before surgery, respectively. RESULTS: The rejection rate in high-risk (74.0%) was significantly higher than that in low-risk (31.0%), (P=0.001<0.05). In high-risk group, the rejection rate in high-MM group (84.8%) was much higher by 1.6 times than that in low-MM (52.9%) (P=0.021<0.05, RR=1.6). However, in low-risk group there was no significant difference of rejection rate between high-MM (30.4%) and low-MM (31.6%) (P=0.936>0.05). CONCLUSION: The results showed that HLA amino acid residue matching play an important role in reducing rejection rate, indicating that accurate HLA typing is necessary before keratoplasty. If possible, the better matched donor-recipient should be chosen according to the HLA amino acid residue matching especially in high-risk group with severe neovascularization.
· KEYWORDS: human leucocyte antigen; amino acid residue matching; keratoplasty
多年来角膜移植术后出现的排斥反应严重影响手术效果，大大降低了手术成功率。近年来对我院角膜移植患者，术前检测人类白细胞抗原(human leukocyte antigen ,HLA)，根据供体与受体HLA位点的氨基酸残基相配数目，筛选供受体，术后观察角膜移植片的透明度、免疫排斥反应迹象，探讨角膜移植术后排斥反应的机制，评价HLA氨基酸残基配型在角膜移植中的作用程度及其临床意义。
1对象和方法
1.1对象 角膜移植手术91例92眼，男56例57眼，女35例35眼，年龄7~70 (平均38.2±9.7) 岁，随访时间3~120（平均53）mo。其中有2例患者因继发性青光眼而再次行角膜移植术。角膜盲原因：单纯性或粘连性角膜白斑19眼，圆锥角膜10眼，角膜皮样瘤5眼，角膜内皮功能失代偿8眼，药物治疗无效的前房积脓性全角膜溃疡7眼，角膜溃疡穿孔、前房消失12眼，角膜瘘伴虹膜嵌顿5眼，反复发作的单纯疱疹病毒性角膜炎（活动期）5眼，化学烧伤或爆炸伤后结膜上皮化的角膜21眼。角膜新生血管数目≥5条或≥2个象限，结膜上皮化的角膜、药物治疗无效的感染性角膜溃疡穿孔者为高危角膜组，50例50眼；其余列入非高危角膜组，41例42眼。
1.2方法 单纯穿透性、板层角膜移植术，或联合 ECCE+ IOL植入，联合自体或异体角膜缘干细胞移植术、联合小梁切除术、联合指环状板层角膜缘移植术，带环形板层巩膜瓣的全角膜移植术。植片大于植床0.2~0.5mm，植片直径6.5~8.5mm，连续或间断缝合（圆锥角膜植片与植床等大，角膜内皮功能失代偿者植片大植床0.5mm）。志愿者死后30min内取供体角膜，深低温保存的供体眼球仅用于板层角膜移植，其余供体角膜均取自湿房保存的新鲜眼球组织，取材后5h内手术。分别采用一步单抗法和 DNA法检测HLA-A, B和 HLA-DR抗原。根据HLA位点氨基酸残基相配数目分组：2错配、3错配、4错配、5错配；又将2错配和3错配归入低错配组，将4错配和5错配归入高错配组（本组资料中尚未发现HLA完全O错配及1错配、6错配）。术后全身、局部应用激素及抗生素3~5d，非糖尿病患者500g/L葡萄糖40mL+2.0g维生素C静注。新生血管丰富的高危角膜以及角膜溃疡、穿孔者口服环孢霉素CSA（每个月测血中CSA的浓度，调整其用量），并适当延长全身用药时间，激素递减。术后第1d开始局部点眼：抗生素眼液、激素眼液、表皮生长因子等眼液点眼。术后1~2wk 10g/L环孢霉素A眼液点眼（圆锥角膜、单纯角膜白斑、角膜内皮功能失代偿者未用CSA）。术后密切观察，定期测定血免疫指标，如发现排斥迹象，及时处理。术后3~6mo拆线。如发现缝线附近已有新生血管入侵或出现排斥反应，则提前拆线。
2结果
高危角膜组排斥反应率为74.0% ( 37/50 )，非高危角膜组排斥反应率为31.0% (13/42 )，χ2＝17.048，P =0.001, 两组间有非常显著性差异。高危角膜组：HLA高错配组的排斥反应率(84.8%)明显高于低错配组 (52.9%)，经Fisher精确检验P =0.021，两组间有显著性差异，相对危险度 RR =1.6。非高危角膜组：HLA高错配和低错配组的排斥反应率分别为30.4%和31.6%，经Fisher精确检验P =0.936，无统计学意义。临床观察还发现：圆锥角膜和单纯角膜白斑者，很少出现排斥反应。当出现排斥反应时非高危角膜组抗排斥药物疗效较好，而高危角膜组疗效差。最小的7岁男孩，为先天性白内障、先天性角膜带状变性，行ECCE +IOL植入术后，最佳视力曾达到0.2。术后1a因角膜溃疡、全角膜混浊，又行穿透性角膜移植术（术中见人工晶状体透明，虹膜无粘连），术后 2wk即出现急性排斥反应，角膜移植片迅速完全混浊，新生血管很快入侵，所有连续缝线全部自动松脱，是所有角膜移植手术中最早出现排斥反应、反应最重的1例。术后因继发性青光眼导致角膜内皮失代偿而再次行角膜移植术2例，其首次及再次移植均选择低错配的供受体，术后配合抗排斥药物治疗，未发现排斥迹象。
3讨论
由于角膜组织特殊的免疫赦免状态，角膜移植术被认为是人体器官组织移植中最成功的手术之一。自 Edward Zirm 成功施行第1例同种异体穿透性角膜移植手术以来，角膜移植术式不断改进，手术适应证不断扩大，手术成功率也逐渐提高，现角膜移植术已成为治疗角膜盲的重要手段。但眼部外伤、炎症、手术刺激等诱因却会使这种免疫赦免状态遭到不同程度的破坏，使其术后排斥反应发生率明显提高，对于高危角膜者更为严重。本组资料中，高危角膜组的排斥反应率就高达74.0 %，这是因为血管化的病变角膜，较快地运送大量的HLA抗原，加速角膜内、外免疫成分的运动，因而破坏了免疫赦免状态，所以高危角膜组移植术后排斥反应发生率明显高于非高危角膜组。
HLA抗原主要为Ⅰ类和Ⅱ类抗原，一般存在于有免疫功能的细胞表面，在不同种族间有很大差异。 HLA与移植排斥反应有关，已有报道同种异体肝、肾、骨髓等移植的成功率与HLA的适合程度成正比，因而主张在移植术前供受者间需先进行组织配型试验，即HLA测定，以了解他们 HLA相适合的程度，并选择最合适的供者[1]。HLA的配型工作已开展了30多年，却很少应用于眼科领域，主要是因为HLA在眼科的作用程度目前尚未有明确的结论或者相关的研究结果还存在较大争议，但至少都认为HLA在角膜移植中确实起到了很大作用[2-6]。我们已将 HLA配型技术应用于临床，并取得了初步结果[7,8]。
确定供受者HLA相匹配的标准是组织器官移植的基础，HLA的遗传特性是高度多态性、种族差异性、连锁不平衡性，应用传统的HLA六抗原配型标准，相配几率少，所以从众多毫不相干的人群中找到HLA完全相同的个体相当困难，而且大量筛选的成本太高，使患者等待供体器官的时间延长，延误了最佳治疗时机。根据HLA存在交叉抗原决定簇及具有连锁不平衡的特点，提出了新的HLA氨基酸残基配型策略。HLA氨基酸残基配型标准的主要依据是[7]：HLA分子346个氨基酸中对移植物排斥与存活率具有重要影响的关键是氨基酸残基，当供受者 HLA的关键部位氨基酸残基相同时，受者的免疫反应性低或无免疫反应性。氨基酸残基配型的最大优点是：能大幅度提高供受者的相配几率，显著降低移植术后的致敏性，还可显著改善移植物的存活率。HLA氨基酸残基相同时，表明遗传同质，排斥反应的可能性小，移植的成功率就高。本资料中年龄最小的一例，HLA- A位点1个相配，HLA—DR位点2个相配，仍出现急性排斥反应，可能还是因为眼部有先天性病变的患儿，二次手术后其郎罕细胞除分布于结膜及角膜缘部外，还大量分布于角膜中央区、旁中央区，致使患儿的排斥反应迅速出现。
尽管本资料尚不能确切说明排斥反应率是否与HLA错配数成正比，角膜移植片的透明度是否与HLA相配程度成正比，但从结果可看出：在高危角膜组中，HLA高错配组的排斥反应率明显高于低错配组（P =0.021），两组之间有显著性差异，其相对危险度RR =1.6，表明高错配组发生排斥反应的危险是低错配组的1.6倍。而低危角膜组患者则相反：高低错配组之间的排斥反应率比较（P =0.936），无统计学意义。所以我们认为，非高危角膜组的排斥反应率与HLA错配并无多大关系。我们的临床观察也显示：圆锥角膜、单纯角膜白斑，不管HLA错配与否，术后仅需常规用药，不需应用环孢霉素A眼液，很少出现排斥反应。另外新生血管较少的，即使 HLA错配，术后排斥反应率也很低，所以提示，对于非高危角膜患者，HLA的配型意义不是很大。但HLA与高危角膜组的排斥反应率有关，特别是4错配、5错配者，排斥反应率更高，建议高危角膜患者，术前进行HLA配型，减少排斥反应发生率。
从目前资料看，尚不能判定到底是HLA的哪个位点起到决定性作用，但我们认为：对于高危角膜，有条件者术前最好进行HLA配型，尽量减少不利因素。而且采用快速、准确的基因配型方法可以节省时间，特别适合于特定的取材环境，患者也很愿意接受。当然，并非所有的HLA位点的氨基酸残基相配就能完全阻止排斥反应的发生，术后仍需密切随访，配合用药。
致谢：信息科陈锦华在数据统计中的指导和帮助。
【参考文献】
1谭建明,唐孝达,谢桐.人白细胞抗原氨基酸残基配型标准与免疫反应性研究.中华医学杂志,1999;79:810-815
2陈梅珠,徐国兴.人类白细胞抗原HLA在角膜移植中的作用.国外医学眼科学分册,2000;24:363-367
3 Volker-Dieben HJ, Claas FH, Schreuder GM, Schipper RF, Pels E, Persijn GG, Smits J, D'Amaro J. Beneficial effect of HLA-DR match on the survival of corneal allografts. Transplantation ,2000;70:640-648
4 Inoue K, Amano S, Oshika T, Tsuru T. Histocompatibility Y antigen compatibility and allograft rejection I corneal transplantation. Eye ,2000;14:201-205
5陈梅珠,郑金树,杨丽霞,谭建明.单眼患者角膜移植术前HLA配型.眼科研究,2001;19:329
6李琦,席兴华.角膜移植免疫排斥反应防治的研究进展.国际眼科杂志,2006;6(5):1126-1129
7谭建明,周永昌,唐孝达.组织配型技术与临床应用.第1版.北京:人民卫生出版社,2002:396-413
8陈梅珠,杨丽霞,王庆华,陈国苍,郑金树,余鹰翔.高危角膜移植术前HLA配型的初步临床研究.中国实用眼科杂志,2003;21(5):333-334
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