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2结果
2.1 AQP4基因表达 AQP4基因在正常视网膜中有表达,高眼压7d表达明显上升,之后虽有所下降，但仍维持在较高水平。Levene方差齐性检验，P=0.071(P>0.05)方差齐; OneWay ANOVA分析P<0.01,故认为AQP4 mRNA在6组中的表达至少有1组与另外1组差异显著;组间多重比较检验(Turky法)表明除高眼压3d组外，各实验组与对照组的差异有统计学意义（图1）。
2.2 AQP4蛋白表达 细胞膜上出现棕黄色颗粒的细胞为免疫阳性细胞。AQP4广泛分布于正常及高眼压视网膜的神经节细胞层，内丛状层、内核层和外丛状层、在外核层也有少量存在。高眼压7d表达明显上升,之后虽有所下降，但仍维持在较高水平。Levene方差齐性检验，P=0.125(P>0.05)方差齐; OneWay ANOVA分析P<0.01,故认为AQP4在6组中的表达至少有1组与另外1组差异显著；组间多重比较检验(Turky法)表明除高眼压3d组外，各实验组与对照组的差异有统计学意义（图2）。
图1 AQP4 mRNA在视网膜的表达 M：Marker；1：对照；2～6：高眼压3，7，14，21，28d（略）
2.3视网膜厚度变化 高眼压7d视网膜明显增厚,节细胞水肿，胞质空亮，内层视网膜间隙增大，14d仍比正常对照组增厚，高眼压21d以后逐渐萎缩，可见到部分节细胞核变小深染。Levene方差齐性检验，P=0.311(P>0.05)方差齐; OneWay ANOVA分析P<0.01,故认为AQP4 mRNA在6组中的表达至少有1组与另外1组差异显著；组间多重比较检验(Turky法)表明除高眼压3d组外，各实验组与对照组的差异有统计学意义（图3）。
2.4 AQP4表达与视网膜厚度相关 Pearson correlation analysis结果为：r=0.578，P=0.02因此认为高眼压后AQP4表达的多少与视网膜厚度变化有相关关系，P＜0.05表明二者之间的相关关系有统计学意义。
3讨论
AQP4广泛存在于哺乳动物体内，主要分布于肺、脑、眼等组织内，在眼部主要分布于睫状体无色素上皮和视网膜[8,9]。AQP4是1994年被克隆确认的水通道蛋白家族中的一员,最初被称为汞不敏感水通道蛋白MIWC (mercurial insensitive water channel)。其分子质量为30×103kDa,在AQP家族中相对分子质量较高,一级结构为跨越细胞膜6次的单肽链,其直线序列是由近似的半个多肽氨基和羧基末端的2个前后排列重复的结构组成,氨基与羧基末端位于细胞内,含有3个胞外环(A，C和E)和2个胞内环(B，D) ,每一结构含3个主要为天冬2脯2丙氨酸的氨基酸,侧面为2个疏水环,即B环和E环的保留残基,B环和E环重叠位于脂质双分子层之间,产生一个使水分子单向通过的通道,这种结构称为沙漏(hourglass)模式[1012],整个分子前后两部分在序列上相似,呈180°定位的正面对称结构。B环和E环反向相对处于孔的中心位置，其任何改变都会引起水通道活性的改变。AQP4 mRNA长度为5.5kb ,N2连接糖基,mRNA变异剪切,AQP家族在人类染色体上均为单一拷贝基因,AQP4基因定位于18号染色体q11.2与q12.1连接处,具有该蛋白家族基因的共同特性,包含4个外显子,编码氨基酸第127，55，27和92位氨基酸序列,其间3个内含子的长度为0.8，0.3和5.2kb ,AQP4基因的转录产物为2.7kb ,编码AQP4的基因也含有1个额外的外显子(外显子0) ,外显子0与其他水通道蛋白没有同源性;AQP4是汞不敏感通道[13]，也不受抗利尿激素调节[14]。AQP4的功能主要为易化水的转运[15]。新的研究表明，AQP4还与应激状态下的组织水肿有关[16]。
图2 慢性高眼压大鼠视网膜AQP4的表达（略）
图3 慢性高眼压大鼠视网膜厚度的变化（略）
另外，一些间接的证据还提示，AQP4还可能和信号转导，细胞容积的调节和细胞器的生理有关[17,18]。已知AQP4和kir4.1钾通道在质膜的同一部位共同存在，因此，推测AQP4可能通过虹吸机制加速快速钾转运[19]从而改变细胞外钾的浓度而影响神经信号转导。
研究发现，脑组织中AQP4的缺乏能对缺血的脑组织起保护作用，AQP4参与了缺血和缺血后CNS的损伤已得到证实。青光眼的损伤机制主要有机械学说和缺血学说。目前普遍认为是两种机制共同作用的结果。脑组织中表达AQP4的胶质细胞对神经元所起的支持作用和视网膜中表达AQP4的胶质细胞如苗勒细胞对双极细胞、节细胞的作用相似[20]。AQP4的表达也参与了急性高眼压过程中视网膜视神经的损伤。一项研究表明AQP4基因消除大鼠急性高眼压后视网膜的水肿和萎缩明显减轻。通过对慢性高眼压过程中视网膜和AQP4表达变化的观察发现，AQP4表达的增高和视网膜的损伤一致，这说明AQP4可能亦参与了慢性高眼压过程的视网膜损伤。AQP4可能通过引起高眼压状态下视网膜应激性水肿参与了慢性高眼压过程中的损伤。通过电凝巩膜表面的静脉制成慢性高眼压模型，观察到在慢性高眼压过程中，视网膜逐渐增厚，到第7d时达到高峰，14d时仍比正常时增厚，在增厚的过程中我们发现节细胞水肿、胞质空亮，内丛状层、神经纤维层都有增厚。之后视网膜逐渐萎缩变薄，神经节细胞逐渐变小，胞核染色质深染。通过RTPCR检测视网膜AQP4在这一过程中的表达，发现AQP4在慢性高眼压过程中逐渐增多，在7d时达到高峰，之后逐渐下降但仍高于正常对照组水平。通过对AQP4表达和视网膜厚度的相关性分析我们发现二者的变化密切相关。已知青光眼视神经损伤的机制目前公认之一是节细胞的凋亡，而细胞内钾浓度的降低是凋亡的始动环节[2123]，AQP4和kir 4.1钾通道在质膜的同一部位共同存在，以往的研究表明，二者在胶质细胞的转运相一致，视网膜胶质细胞主要是Müller细胞及其伸出的突起包绕在节细胞周围，对其营养、水及离子的转运产生影响[24]。因此，推测AQP4可能通过虹吸机制加速快钾的转运从而减低神经元细胞钾的浓度而影响神经信号的转导。在本实验中我们发现，在高眼压后21d后，视网膜各层与正常对照组相比已经变薄，提示已经存在神经元的凋亡，此时，尽管视网膜已无水肿存在，但AQP4的表达仍明显高于对照组，这说明此时AQP4有可能通过影响神经元细胞钾的浓度而使损伤进一步加重[25]。我们发现AQP4 mRNA的表达与蛋白表达都是在7d有明显升高，之后的时间段内其表达虽有下降，但仍高于对照组。二者在时间变化上相一致。这表明，高眼压后AQP4的表达变化在转录阶段就已经开始，并可能在转录和转录后的多个阶段存在调控点，他们共同起作用或以其中之一为优势。这一发现可能会为通过抑制AQP4表达减轻青光眼损伤的研究提供新的作用点。
对AQP4的抑制可从两方面着手。首先，对AQP4表达的抑制。既然高眼压后AQP4的变化在转录阶段就已经开始，那么就可以从转录和转录后阶段对其进行抑制。如应用特异性的转录酶抑制剂抑制其转录，通过转染的方法抑制其翻译。目前，通过体内转染的方法来治疗某些眼部疾病已取得了很大进展，如通过玻璃体内转染来治疗年龄相关性黄斑变性的方法已投入临床使用[26]，因此通过这种方法来治疗青光眼也成为可能。其次，AQP4表达后的抑制。AQP4的分子结构表明，AQP4发挥功能的关键部位是B环和E环，而B环和E环的氨基酸序列也十分清楚，因此通过设计针对B环和E环的特异性抑制剂也可达到抑制的目的。
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