【摘要】 目的:观察以干燥脱水法保存的鸵鸟角膜基质为载体构建人工生物角膜上皮组织的生物学特性。 方法:采用组织块培养法获得新西兰大白兔角膜缘干细胞，经胰蛋白酶消化法获得细胞，种植于干燥脱水法保存的鸵鸟角膜板层基质上，采用气液界面培养法进行培养，通过倒置显微镜、透射电子显微镜、荧光显微镜观察其形态学、生长特点，超微结构及免疫学特征。 结果:在干燥脱水法保存的鸵鸟角膜基质上种植兔角膜缘干细胞，接种72h后，细胞形成单层，移置气液交界面后继续培养7～10d，逐渐形成复层。经光镜、透射电镜、及免疫学检测显示其具有角膜上皮组织的生物学特性。结论:兔角膜缘干细胞能够在干燥脱水法保存的鸵鸟角膜基质载体上生长，并可形成复层，基本具有正常角膜上皮细胞的形态、超微结构和生物学特性。
【关键词】 兔角膜缘;干燥脱水法保存鸵鸟角膜基质;干细胞;细胞培养;人工生物角膜上皮组织
Constructing artificial biologic cornea epithelial tissue on the carrier of heterogenic corneal stroma stored with desiccation and dehydration method
XianNing Liu1, XiuPing Zhu1, Yong Yin1, Jie Wu2, Hua Yang1, ChangNing Zhang2
Foundation item:Key Project Foundation of Shaanxi Provincial Science and Technology Department (No.2003K10G29)
1Shaanxi Provincial Ophthalmic Institution, Xian 710002, Shaanxi Province, China; 2 Xian Eye Hospital, Xian 710002, Shaanxi Province, China
AbstractAIM: To observe the biologic features of the artificial biologic cornea epithelial tissue constructed on the carrier of heterogenic corneal stroma stored with desiccation and dehydration method.
METHODS: Limbal stem cells of New Zealand white rabbits were obtained with tissue block culture method. The cells gotten from trypsin digestion method were implanted on heterogenic corneal stroma stored with desiccation and dehydration, and cultured by airliquid culture method. The morphology, growth, ultrastructure and immunology characteristics were observed under inverted microscope, transmission electron microscopy and fluorescence microscope.
RESULTS: After 72 hours, limbal stem cells implanted on heterogenic corneal stroma formed single layer. Seven to ten days after transplanted to airliquid interface, the cells formed multi layer, which had biological characteristics of corneal epithelium tissue under inverted microscope, transmission electron microscopy and fluorescence microscope.
CONCLUSION: Limbal stem cells of rabbits can grow on the carrier of heterogenic corneal stroma stored with desiccation and dehydration method, and can form multi layer. The cells have the shape, ultrastructure and biological characteristics of corneal epithelium tissue.
KEYWORDS: rabbit corneal limbal; heterogenic corneal stroma stored with desiccation and dehydration method; stem cells; cell culture; artificial biologic cornea epithelial tissue
Liu XN, Zhu XP, Yin Y, et al. Constructing artificial biologic cornea epithelial tissue on the carrier of heterogenic corneal stroma stored with desiccation and dehydration method. Int J Ophthalmol
(Guoji Yanke Zazhi)2008;8(11):22142216
0引言
据统计，每年由角膜病及外伤而致盲的病历居全球致盲性眼病的首位[1]。同种异体角膜移植是治疗角膜盲的根本手段。苦于供体材料来源困难，严重制约了该手术的开展和普及。离体角膜缘干细胞的培养成功，无疑为那些角膜缘功能衰竭患者带来希望[2]。如何构建人工生物角膜，是眼科界最新、最有前景的研究热点。我所利用干燥脱水保存的鸵鸟角膜基质为载体材料，并在其上培养成功富含角膜缘干细胞的上皮基质膜片，为进一步角膜移植体外培养的干细胞创造条件。
1材料和方法
1.1材料 兔眼角膜缘组织来源：4～6mo龄健康新西兰大白兔（西安交大医学院实验动物中心提供符合国家实验动物使用标准，质量2.0～2.5kg，雌雄不限）,鸵鸟眼球:西安英考王驼鸟公司提供。DMEM/F12 1∶1培养基（美国GIBCO公司）；胎牛血清（美国GIBCO公司）；青霉素和链霉素（山东鲁抗医药股份有限公司）抗角蛋白K3单克隆抗体AE5（CHEMICON EUROPE公司）;抗PCNA单克隆抗体（博士德生物工程有限公司）；纤维连接蛋白（FN）、层粘连蛋白（LN）（陕西众美生物科技有限公司进口分装）。
1.2方法
1.2.1鸵鸟角膜基质载体准备与保存[2] 以无菌操作取出鸵鸟眼球，用1/10000升汞溶液，生理盐水，2000U/mL庆大霉素液交替冲洗，刮除角膜上皮，剖切获取驼鸟角膜基质层，厚约200μm，采用含 2.5g/L胰蛋白酶、0.2g/L EDTA的HanKS液37℃消化60min去除残余的上皮及基质游离细胞。将处理好的角膜基质片放在一无菌平皿中，置于干燥器内，干燥器盖边缘涂凡士林悬紧密封，置于4℃冰箱，干燥脱水48h后取出，在无菌条件下置于准备好的保存瓶内，加盖密封，贴上标签注明供体取材时间等。使用前先检查保存瓶内兰色硅胶有无变色（如变红色说明水分进入，弃之不用），复水后再检查保存角膜基质片有无裂纹破裂浑浊。达到保存质量标准的方可使用。接种细胞前复水，紫外线照射灭菌双面各30min，置4孔板备用。
1.2.2载体基底膜化处理 用0.1g/L FN浸泡载体，置37℃培养箱孵育1h，取出，再放入0.1g/L LN液体中浸泡,置37℃培养箱孵育1h，吸出液体培养箱内干燥1h备用。
1.2.3细胞接种 无菌条件下取兔眼球，用含青霉素、链霉素（200U/mL）的生理盐水反复冲洗眼球，剪下角膜缘，切除残存的结膜和色素组织，去除角膜内皮及大部分基质，将其切成1mm×2mm组织块，置培养瓶中，上皮细胞面向上，加入细胞培养液（DMEM与F12Hum培养基1∶1混合物，含200mL/L胎牛血清，100U/mL青、链霉素，4mmol/L谷氨酰胺、1000U/L胰岛素，5μg/L表皮生长因子，0.18mmol/L腺嘌呤等），置37℃，50mL/L的CO2恒温培养箱培养。根据代谢情况，3～4d换液一次，当细胞密度达到80%～90%时进行消化传代，按2×105个细胞/mm2面积接种于铺有驼鸟角膜基质的4孔培养皿中，培养条件同前；于倒置显微镜下观察细胞的生长情况并摄影记录。当细胞生长72h，取细胞膜片移置入Transwell培养板进行培养，载体的底面为培养液，上皮面暴露于气体中，形成气液交界面，继续培养7～10d形成复层。
2结果
倒置显微镜下所见:兔角膜缘干细胞接种于鸵鸟角膜基质上，72h，形成单层细胞膜片，细胞呈卵圆形、胞质丰富，核质比为1∶2(图1)。光镜下所见：培养1～7d，组织切片HE染色，见上皮细胞4～5层，细胞呈极性排列，就基底部为柱状细胞，其上为翼状细胞，最上为扁平状细胞，形态近似正常上皮的复层结构。基质层为胶原纤维(图2)。透射电镜所见：培养7～10d可见多层细胞，含丰富的细胞器，可见基底细胞特有的张力丝、基底膜及细胞间桥粒连接(图3，4)。免疫荧光染色所示：培养7～10d，胰酶消化膜片上皮细胞层采用抗PCNA的单克隆抗体及抗K3的单克隆抗体及进行间接免疫荧光染色,结果具有阳性表达证实其角膜缘干细胞来源及有分化的角膜上皮细胞表型(图5，6)。
图1倒置显微镜下兔角膜缘干细胞接种于鸵鸟角膜基质上72h生长形态为圆形、卵圆形、胞核大、细胞透亮（×200）
图2光镜下兔角膜缘干细胞在干燥脱水保存的鸵鸟角膜基质上生长的组织结构图（×200） 上皮细胞4～5层，细胞呈极性排列，较生理状态下紊乱；基底部为柱状细胞，其上为翼状细胞，最上为扁平状细胞，形态接近正常上皮的复层结构；基质层为胶原纤维，排列较紊乱
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