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THP-1细胞对体外培养的人视网膜色素上皮细胞 c-fos表达的上调作用

http://www.cnophol.com 2009-5-31 11:12:59 中华眼科在线

    【摘要】  目的 检测与单核/巨噬细胞株THP-1细胞共培养的人视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞c-fos的表达。方法 在Transwell小室中共培养THP-1细胞和人RPE细胞达不同的时间(0,2 h,3 h,24 h,48 h,72 h),采用免疫荧光染色法和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)观察RPE细胞c-fos蛋白和mRNA的表达变化。结果 在未与THP-1细胞共培养的RPE细胞中,c-fos表达微弱或不表达,细胞浆和部分细胞核为浅黄绿色荧光。与THP-1细胞共培养达2 h时,RPE细胞的荧光强度逐渐增强并出现核移位。随着与THP-1细胞共培养时间的延长,RPE细胞c-fos mRNA的表达(0 h,0.40±0.07)开始逐渐增强,于2 h时达峰值(2 h, 0.91±0.10,P=0.002),随后表达减弱,至3 h时(3 h,0.51±0.08)降至近未共培养时的水平。结论 与THP-1细胞共培养可在短期内迅速上调体外培养的人RPE细胞c-fos蛋白和mRNA的表达,且蛋白表达出现核移位现象,提示THP-1细胞可引起RPE细胞c-fos的活化。

    【关键词】  视网膜色素上皮;THP-1细胞;c-fos

Up-regulation of c-fos in cultured human retinal pigment epithelial cells by co-culturing with THP-1 cells

    WANG Jingbo*, HUI Yannian, GUAN Juan*, et al.

    * Department of Ophthalmology, the Second Affiliated Hospital, General Hospital of Chinese People’s Liberation Army, Beijing China, 100091

    [Abstract]  Objective  To study the effects of co-culturing with THP-1 on the expression of c-fos in human retinal pigment epithelium (RPE) cells in vitro. Methods  RPE cells were co-cultured with THP-1 cells in transwell inserts for 0, 2, 3, 24, 48 and 72 h. Immunofluorescence staining and reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) were used to detect the levels of c-fos protein and mRNA in RPE cells. Results  RPE cells that were not co-cultured with THP-1 cells revealed either faint or no green fluorescence of c-fos in the cytoplasm and some nuclei. When co-cultured with THP-1 cells for 2 h, green fluorescence labeling of c-fos showed an obvious increase with stronger green fluorescence translocated to the nuclei. After co-culturing with THP-1 cells, c-fos mRNA (0 h, 0.40±0.07) increased rapidly in RPE cells and the enhancement peaked at 2 h (2 h, 0.91±0.10, P=0.002), and declined to a similar level as the cells that were not co-cultured after 3 h (3 h, 0.51±0.08). Conclusion  Co-culturing with THP-1 cells can quickly up-regulate c-fos protein and mRNA in cultured human RPE cells within a short time period, and induces its nuclear transposition, which suggests the THP-1 cells can activate c-fos.

    [Key words]  retinal pigment epithelium; THP-1 cell; c-fos

    视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium, RPE)细胞是参与葡萄膜炎、增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy,PVR)等[1]多种眼病的重要细胞[1-3]。其中单核/巨噬细胞的浸润参与了这些眼病的发生和发展,并对RPE细胞的早期基因改变及其后的生物学性状变化起关键作用。c-fos为一重要的核转录因子,属于即刻早期反应基因家族[4],是与多数细胞增殖有关的原癌基因。本实验中,我们欲研究与单核/巨噬细胞株(THP-1细胞)共培养的体外培养的人RPE细胞的c-fos表达,从而明确c-fos在RPE细胞早期生物学性状改变中的作用。

    1  材料和方法

    1.1  材料  Dulbecco改良Eagle培养基(Dulbecco’s modified Eagle medium, DMEM)购自美国Hyclone公司,新生小牛血清购自杭州四季青公司,Trizol试剂购自美国Invitrogen公司,反转录试剂盒购自美国Promega公司,Taq酶购自美国MBI公司,兔抗人c-fos多克隆抗体购自武汉博士德公司,异硫氰酸荧光素(FITC)标记羊抗兔IgG购自北京中杉公司,其他试剂均为国产或进口分析纯。c-fos引物由上海生工合成。3个不同个体成年健康男性角膜移植后的眼球用于行原代RPE细胞培养,取第4~第8代细胞用于实验。THP-1细胞购自美国标准生物品收藏中心。

    1.2  方法  c-fos引物,上游5′ TGCTGAAGGAGAAGGAAAAA 3′,下游5′ TGCATAGAAGGACCCAGATA 3′ [344碱基对(bp)];甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)引物,上游5′ GAAGTGAAGGTCGGAGTCA 3′,下游5′ TTCACACCCATGACGAACAT 3′(402 bp)。

    RPE细胞消化后,接种于6孔培养板中,置于5% CO2孵箱中培养。当细胞融合>75%时,将Transwell小室置于培养孔上,并将THP-1细胞接种于小室上方,分别共培养达0、2 h、3 h、24 h、48 h和72 h。细胞共培养结束后,拿去Transwell小室,弃去培养液,换以37℃预热的磷酸盐缓冲液(PBS)并轻柔晃动培养板2次,然后收集细胞,以备行RNA提取。同时设对照组,即为RPE细胞更换37℃预热的、含10%新生牛血清的新鲜DMEM,培养时间分别达0、2 h、3 h、24 h、48 h和72 h。

    RPE细胞在共培养结束后,以台盼蓝染色计数法检测各处理组的活细胞数目。具体步骤如下:收集各孔细胞,制备成单细胞悬液,并与等体积的0.3%的台盼蓝溶液混合,在光学显微镜下计数并计算细胞存活率。

    细胞爬片用95%乙醇固定20 min,PBS漂洗;用3%过氧化氢灭活15 min,PBS漂洗;用羊血清室温封闭20 min;加入0.5% 曲拉通X-100,室温置10 min;置兔抗人c-fos多克隆抗体(1∶100),湿盒4℃过夜,PBS漂洗;用FITC标记羊抗兔IgG(1∶100),湿盒37℃孵育60 min,PBS漂洗;用甘油缓冲液封片,激光共聚焦显微镜观察并在同一电压条件下照相。同时设PBS替代第一抗体的空白对照。

    收集的细胞用Trizol提取总RNA,反转录合成cDNA第1链,产物进行PCR。退火温度分别为:c-fos,54℃,1 min;GAPDH,55℃,1 min。GAPDH反应为30个循环,c-fos为35个循环。PCR产物以1%琼脂糖凝胶电泳,紫外灯下观察照相。采用Kodak Digital Science 1D分析软件分别读取各片段灰度值,以c-fos的灰度值与GAPDH灰度值的比值代表c-fos mRNA的水平。

    1.3  统计学方法  采用SPSS 13.0统计分析软件,对刺激因素作用后不同时间点间的比较进行单因素方差分析。绘图采用Origin 7.0软件。

    2  结果

    2.1  细胞活力检测结果  台盼蓝染色实验测得,RPE细胞与THP-1细胞共培养后,细胞的存活率在96%以上。

    2.2  免疫荧光染色结果  在尚未与THP-1细胞共培养的RPE细胞中,c-fos表达微弱或不表达,细胞浆和部分细胞核为浅黄绿色荧光(见图 1)。随着与THP-1细胞的共培养时间的延长,RPE细胞c-fos的表达逐渐增强,荧光强度增高,呈绿色或深绿色。THP-1细胞共培养达2 h时,与未行共培养的RPE细胞比较,c-fos的表达明显增强,并出现核移位,细胞核呈强绿色荧光(见图 2)。在与THP-1细胞共培养后,RPE细胞c-fos蛋白表达的荧光强度于2 h时达峰值,随后荧光强度开始减弱,并逐渐降至未行共培养时的荧光强度水平。对照组各时间点RPE细胞c-fos的表达无明显改变。

    2.3  THP-1细胞共培养上调RPE细胞c-fos mRNA的表达  与尚未共培养的RPE细胞相比,与THP-1细胞共培养达2 h时,RPE细胞c-fos mRNA的表达即显著增强(F=52.37,P=0.002),随后表达开始减弱,于3 h时降至与未共培养时的相近水平,随后基本维持在该水平(见表1、图3)。对照组内各时间点c-fos mRNA的表达变化无统计学意义(F=0.75,P=0.64)。

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(来源:互联网)(责编:duzhanhui)

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