0引言
早产儿视网膜病变(retinopathy of prematurity，ROP)是以视网膜新生血管为主要表现的疾病，早产、出生低体重和吸高浓度氧为已知的发病因素，目前的研究发现视网膜细胞凋亡也是其主要损害之一。雌激素是一类维持机体正常生理状态的重要性激素，目前研究发现雌激素对于神经细胞包括视网膜神经节细胞具有保护作用[1]。我们通过观察各组视网膜神经节细胞层(retinal ganglion cell layer，RGCL)的细胞形态和TUNEL染色，明确雌激素对于高氧诱导的视网膜细胞凋亡的作用，并探讨其机制。
1材料和方法
1.1材料 清洁级7天龄Sprague Dawley(SD)新生大鼠48只（中国科学院上海实验动物中心提供)，17β雌二醇（17βestradiol）（Sigma公司，美国） ，原位细胞凋亡检测试剂盒(Roche公司，美国)，氧气分析仪（梅城电化分析仪器厂，CY12C），小鼠抗大鼠诱生型一氧化氮合酶（iNOS）多克隆抗体（Santa cruz公司，美国），即用型SABC免疫组化染色试剂盒和DAB染色盒（武汉博士德生物工程有限公司）。
1.2方法 48只7天龄SD大鼠随机分为4组，每组12只。组1(正常组)：幼鼠在正常空气环境下饲养至17天龄。组2(单纯给氧组)：小鼠置于密闭容器内，调节氧气流量，使容器内氧浓度保持在750 ±20mL/L，在该容器中饲养5d至小鼠12天龄，然后置于正常空气环境下饲养至17天龄。组3(雌二醇干预组)：饲养同组2，但在小鼠吸氧前即7天龄时行皮下注射雌二醇(E2，植物油稀释，配制浓度为2g/L)0.5μL/d，1次/天,至小鼠17天龄。组4(溶媒高氧组)：饲养及给药方法同组3，药物改为相同体积的植物油。取各组17d幼鼠右眼球，常规脱水，石蜡包埋。将蜡块行矢状位连续切片，片厚5μm，每个组织块随机取连续切片3张行HE染色，观察RGCL层的细胞形态和组织结构。凋亡细胞常为单个细胞，形态特点为细胞体积缩小、染色质致密聚集成斑块状。
1.2.1 TUNEL染色 眼球行石蜡切片，常规脱蜡水化，30mL/L过氧化氢室温下处理10min，蒸馏水洗后加Proteinase K(0.01mol/L TBS 1∶200新鲜稀释)于37℃下消化15min，0.01mol/L PBS洗后加标记缓冲液20μL，甩干后将包括阳性对照片在内的每张切片加标记液20μL (TdT和生物素各1μL，18μL标记缓冲液)，另取1张切片仅加入20μL标记缓冲液作为阴性对照，置于37℃ 湿盒中反应2h，经封闭液处理后滴加1∶100稀释的1mL抗体稀释液加生物素抗地高辛抗体10μL混匀液，置于37℃ 湿盒中反应30min，滴加1∶100稀释链酶亲和素一过氧化物酶，混匀后滴加50 片，37℃湿盒中反应30min，DAB显色，观察RGCL细胞染色情况，比较阳性和阴性对照片，将细胞核中有棕黄色颗粒者判定为阳性细胞。TUNEL标记后，由两名非本课题组并且熟悉凋亡细胞形态的实验人员对所有TUNEL标记切片进行计数，首先计数TUNEL标记阳性细胞（细胞核被标记呈棕黑色）；其次结合光镜下细胞形态，鉴别阳性细胞中凋亡细胞（符合凋亡细胞形态特征）。
1.2.2 iNOS免疫组织化学检测 按试剂盒说明进行石蜡切片常规切片脱蜡至水，滴加3mL/L过氧化氢室温孵育10min，0.01mol/L枸橼酸盐缓冲液（pH值6.0）高压抗原修复3min，滴加正常血清封闭液10min，滴加iNOS（工作浓度为1∶50）一抗工作液4℃过夜，滴加生物素标记山羊抗鼠lgG二抗室温孵育30min，链霉亲和素生物素过氧化物酶复合物（streptavidinbiotin peroxidase complex,SABC）37℃ 30min,DAB显色，苏木素复染后封片。应用美国ImagePro plus专业图像分析软件对视网膜细胞中iNOS的免疫组织化学反应做定量测定：每只眼球随机抽取3张切片，测其累计吸光度（A）并取均值。分析过程中所有切片的放大倍数（×400）、光源强度均相同。
统计学分析：使用SPSS 13.0软件对所有数据进行统计学分析。两组间均数比较，组间两两比较均采用方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。
上一页 [1] [2] [3] [4] 下一页 |
