3  讨论　　

     C57BL/6J小鼠在出生后14 d左右眼睑自然睁开，既往研究表明，小鼠在出生后2周左右内，视网膜仍然存在显著、有序的发育和分化过程[4-5]。本实验在成功建立新生C57BL/6J小鼠提前开睑模型的基础上，研究在视网膜发育逐步成熟的过程中melanopsin在mRNA和蛋白水平含量的变化，以及提前光照对melanopsin表达的影响。免疫荧光的结果提示，melanopsin阳性神经节细胞（光敏感性神经节细胞）在5天龄时表达最多，之后表达减少，在90天龄时melanopsin阳性神经节细胞表达最少。由于melanopsin阳性细胞占神经节细胞数量的比例很少（在成年C57BL/6J小鼠约1%的神经节细胞表达melanopsin[6]），免疫荧光方法也无法准确量化阳性细胞的表达量，据此我们为了验证以上结果和更进一步地证实提前光照组和对照组melanopsin表达的差异，运用RT-PCR和western blotting法由mRNA和蛋白水平检测melanopsin的表达状况。两者结果都提示，在视网膜神经节细胞发育过程中，提前开睑组和对照组melanopsin含量均逐步下降，在5天龄到14天龄过程中下降趋势明显，在14天龄到90天龄过程中下降趋势趋于平缓；组内比较，14天龄之前提前光照组melanopsin的表达低于相应对照组。以上证据表明，小鼠从出生到14天龄之前阶段是视网膜光敏感性神经节细胞发育的关键时期，在这一时期内melanopsin表达逐渐减少，14天龄之后melanopsin表达基本稳定。目前这一生理变化发生的机制还不清楚，但光刺激可以下调melanopsin的表达。　　

    既往研究表明，在光刺激传导过程中，melanopsin阳性神经节细胞主要功能是感受和传递光信号，melanopsin接收光照强度变化的刺激，引起其分子构象发生变化，光敏感性神经节细胞因此兴奋，产生慢速去极化的动作电位并释放谷氨酸、垂体腺苷酸环化酶活性肽（PACAP）等递质，并通过视网膜下丘脑束（RHT）传导通路，将视网膜的光信号投射到大脑的视交叉上核等部位发挥相应的功能[7]。因此在视网膜发育过程中，melanopsin的含量逐渐减少可能为机体对光刺激的一种适应性的调节，可能是melanopsin与其受体结合后影响一系列生长因子和生物活性物质的代谢过程，最终导致melanopsin的mRNA、蛋白和活性水平的改变。其中多巴胺（dopamine）可能是重要的转录因子，参与melanopsin基因转录和翻译的调控。已知dopamine在视网膜发育、细胞凋亡、明适应等方面具有重要作用[8]。Vugler等[9]研究发现一定量的dopamine维持melanopsin的表达，光刺激使dopamine表达减少，从而减少melanopsin的表达。设想可以通过阻断dipamine受体途径等进一步实验研究证实melanopain的表达是否受到影响并探索其内在机制。

    以上现象的发现具有一定的临床意义，哺乳动物在胚胎期就有melanopsin的表达，光敏感性神经节细胞在出生时就已有感受光刺激的功能[10-11]，而视杆和视锥细胞在出生后10 d左右才有此功能[12]，因此在视觉成像系统还不具备功能的时候，melanopsin阳性神经节细胞就已经发挥非视觉成像作用了，提示我们新生儿过早过多地暴露在强光下可能对视网膜发育、眼和脑的正常生理功能带来损害。另外研究还发现一个有趣的现象，一些盲人虽然视杆和视锥细胞都已经完全退化，但melanopain阳性神经节细胞却基本没有受到影响，这些细胞依然可以感受光照强度的变化，具有调节生物钟的功能[13]，这一现象提示我们不能单纯为了美观的需要将盲人的眼球摘除。Melanopain在视觉发育过程中具有重要作用，期望本实验能为melanopsin光感受功能机制的进一步深入研究提供参考。

   【参考文献】

[1] Lucas RJ， Freedman MS， Soni B， et al. Regulation of mammalian circadian behavior by non-rod， non-cone ocular photoreceptors[J]. Science，1999，284(5413)：502-504.

[2] Lucas RJ， Douglas RH， Foster RG， et al. Characterization of an ocular photopigment capable of driving papillary constriction in mice[J]. Nat Neurosci，2001，4(6)：621-626.

[3] Hattar S， Liao HW， Takao M， et al. Melanopsin-containing retinal ganglion cells：architecture， projections， and intrinsic photosensitivity[J]. Science，2002，295(5557)：1065-1070.

[4] Braekevelt CR， Hollenberg MJ. The development of retina of the albino mice[J]. Am J Anat，1978，127(3)：281-302.

[5] Young RW. Cell death during differentiation of the retina in the mouce[J]. J Comp Neurol，1984，229(3)：362-373.

[6] Provencio I， Rollag MD， Castrucci AM. Photoreceptive net in the mammalian retina. This mesh of cells may explain how some blind mice can still tell day from night[J]. Nature，2002，415（6871）：4493.

[7] Hannibal J， Georg B， Fahrenkrug J， et al. Melanopsin changes in neonatal albino rat independent of rods and cones[J]. Neuroreport，2007，8(1)：81-85.

[8] Djamgoz MB， Hankins MW， Hirano J， et al. Neurobiology of retinal dopamine in relation to degenerative states of the tissue[J]. Vis Res，1997，37（24）：3509-3529

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