【摘要】  目的：通过激光诱导色素家兔脉络膜新生血管（choroidal neovascularization，CNV）模型，探讨结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）在CNV形成中的作用。方法：用高强度半导体泵浦的倍频Nd：YAG 532nm绿激光光凝兔视网膜后极部，诱发CNV。术后1，3，4wk用原位杂交方法检测 CTGF mRNA在CNV中的表达。结果：光凝后1wk，CNV膜开始形成，CTGF mRNA主要表达于CNV及其附近；光凝后3，4wk，CTGF mRNA仍明显表达，并有增强的趋势。结论：结缔组织生长因子可能参与了实验性CNV的发生发展。

   【关键词】  脉络膜新生血管

    引言

    黄斑区脉络膜新生血管(choroidal neovasculariz- ation,CNV)膜形成是年龄相关性黄斑变性(age-rela- ted macular degeneration,AMD)、高度近视眼等眼底病中造成视力丧失的最主要原因。实验诱导和手术切除新生血管膜的组织学和免疫组织化学研究证实多种生长因子包括血管内皮生长因子（VEGF）、转化生长因子β（TFG-β）等在CNV形成的促进作用[1-5]。结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）是新近报道的高度保守的即刻早期基因CNN(CTGF,cyr,nov)家族成员之一，它在伤口愈合和纤维化过程中起主要作用[6-8]。最近的研究认为CTGF在促进纤维化过程中，也促进血管形成，在体内、体外都促进血管内皮细胞的生成、增生和迁移[9,10]。但目前鲜见对CTGF和CNV关系的研究，我们希望通过激光诱导的CNV膜型探讨CTGF在CNV形成中的作用。

    1材料和方法

    1.1材料  健康有色家兔24只，右眼为实验眼，左眼为正常对照。雌雄不限，体质量1.5～2.5kg，由中南大学湘雅二医院实验动物中心提供。实验前经裂隙灯、眼底镜检查双眼无异常。原位杂交检测试剂盒购自武汉博士德公司。因为人和兔有95%的同源性，选用针对人CTGF靶基因的mRNA序列为5’-CTGCT GCCGC  GTCTG CGCCA AGCAG CTGGG -3’，合成的探针用地高辛5’末端标记。DAB显色剂等其他分析纯均购自武汉博士德公司。半导体泵浦的倍频Nd：YAG 532nm绿激光机（法国Quantel Medical SA公司的Viridis Twin型）；荧光素眼底血管造影仪（fundus fluorescein angiography，FFA）（日本Topcon 公司TRC-50Ex型）。

    1.2方法  复方托品酰胺眼液和新福林散瞳，肌注盐酸氯胺酮（50mg/kg）和地西泮（2.5mg/kg）麻醉后，丁卡因角膜表面麻醉放置三面镜，用倍频Nd：YAG 532nm绿激光机，在视盘下方1～2PD击射20点。激光击射参数：光斑直径50μm ，功率0.8W，时间0.05s，光斑间距100μm；激光反应斑以见到有气泡出现或少量出血,提示Bruch膜被击穿为准，并于激光击射后7，21，28d麻醉动物行眼底彩色照像及FFA检查。于激光击射后不同时间段，用空气栓塞法处死动物，去除眼周软组织，下方标记后置于40g/L的甲醛溶液中固定24h，然后沿赤道部剖开，去除眼前节，取包括视盘及下方的全层眼球壁组织，常规脱水、浸蜡、石蜡包埋，以激光斑为中心制成3μm厚的连续石蜡切片,一张常规HE染色光镜下观察CNV。选取含CNV激光斑的石蜡切片常规脱蜡至水。原位杂交方法测定CTGFmRNA的表达：30mL/L H2O2室温处理10min，30mL/L檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶37℃消化30min，期间0.5mol/L PBS或DEPC水充分洗涤37～40℃进行预杂交4h，吸取多余液体，不洗，然后40～42℃杂交过夜。杂交后30～37℃水温的不同浓度的SSC充分洗涤，再滴加封闭液，滴加生物素化鼠抗地高辛，滴加SABC，滴加生物素化过氧化物酶，每一步之间用0.5mol/L PBS充分洗涤。最后,显微镜下控制DAB显色时间，苏木素复染，乙醇脱水，二甲苯透明，封片，显微镜下观察照像。步骤按照试剂盒说明进行，阴性对照用预杂交液代替杂交液染色。结果以细胞质内出现黄色或棕黄色为阳性信号。

    2结果

    在正常组织中，视网膜脉络膜未见CTGFm RNA表达（图1）。光凝1wk后，脉络膜新生血管膜形成。光镜下观察主要由色素性巨噬细胞、迁移增殖的RPE细胞、神经胶质细胞和长梭形的、胞体较大、胞核为卵圆形的成纤维细胞样细胞组成（图2）， CTGFmRNA一部分阳性标记位于CNV及附近梭形组织，另一部分阳性标记位于血管内皮细胞及神经节细胞层（图3）。随着CNV发展，CTGFmRNA阳性染色有增强的趋势。

    图1  正常色素家兔视网膜CTGFmRNA阴性表达DAB×400

    光凝术后1wk（A）光凝术后3wk(B)CNV形成（*标记）

    图2  色素家兔视网膜HE×400

    A：CTGF mRNA一部分阳性标记于CNV及附近组织DAB×400；B:另一部分标记于血管内皮细胞及神经节细胞层DAB×200

    图3  CNV色素家兔视网膜CTGFmRNA

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