【摘要】 探讨磷脂酰肌醇-3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K）在缺氧诱导的人视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium, RPE）细胞增生中的作用。方法：利用CoCl2法建立培养细胞缺氧模型。在缺氧条件下培养人RPE细胞1，4，8，12和24h，流式细胞仪检测RPE细胞的增生活性，RT-PCR和Western blot检测磷酸化PI3K mRNA和蛋白的表达水平。用30μmol/L PI3K特异性阻断剂LY294002处理RPE细胞，作为阻断实验组。结果：随缺氧时间延长，RPE细胞增生活性逐渐增高，磷酸化PI3K mRNA和蛋白表达水平逐渐增高。LY294002处理组较对照组RPE细胞增生活性显著降低（P ＜0.05）。结论：缺氧诱导的RPE细胞增生部分是通过PI3K信号转导通路实现的。
【关键词】 磷脂酰肌醇3-激酶
0引言
在年龄相关性黄斑变性（age-related macular degeneration, AMD）眼内，由于脉络膜新生血管（choroidal neovascularization, CNV）生成，继发一系列渗出、出血和瘢痕形成等改变，导致患者视力明显下降，甚至丧失。实验及临床研究表明，CNV的发生与脉络膜局部缺氧有关[1]。在CNV的发生过程中，人视网膜色素上皮（retinal pigment epithe- lium, RPE）细胞起着重要的调控作用。在缺氧条件下，RPE细胞通过诱导各种细胞因子的释放，引起包括血管基底膜的降解、血管内皮细胞(endothelial cells, EC)的增生、趋化和移行以及新基底膜的沉积等一系列反应，最终导致新生血管管腔的形成[2]。由于CNV的形成是多种分子共同作用的结果[3]，而分子间的相互作用又错综复杂。因此，寻找一个能够调控RPE细胞生长的关键信号通路可能对于防治CNV具要重要意义。近十几年研究发现，磷脂酰肌醇-3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K）是一种与细胞信号转导有关的酯类第二信使，广泛参与细胞信息传递、分泌、离子通道调节、细胞增生、分化，抑制细胞凋亡等一系列与生命现象密切相关的过程，从而提示PI3K在细胞增生过程中起到十分重要的调节作用[4]。但是该信号转导机制在RPE细胞增生中的作用尚不十分清楚，我们对此进行了初步的探讨。
1材料和方法
1.1材料 人RPE细胞取自角膜移植术后供体眼球，分离、培养及鉴定方法同前[5,6]，第4～7代细胞用于实验。将RPE细胞以1×106个细胞接种于10cm的培养皿中，培养72h后更换为无血清培养基（serum-free medium, SFM）培养。实验分阻断剂处理组和对照组。处理组加入阻断剂LY294002 30μmol/L（美国Cell Signal公司），作用1h后，处理组和对照组分别加入CoCl2 200μmol/L以建立RPE细胞化学缺氧模型。继续培养1，4，8，12和24h分别用于以下检测。
1.2方法
1.2.1细胞增生指数的检测 消化、收集RPE细胞，PBS洗涤3次，700mL/L冰乙醇室温固定20min。再行PBS洗涤3次，加入1mL PIsoulution（由1g/L Triton, 2mg DNase-free RnaseA，1g/L PI200μL组成），室温放置15min，混匀，过滤，4℃，避光放置30min，用流式细胞仪FACStar检测细胞增生指数，每组3例。计算出S+G2/M期细胞所占细胞总数（G0/G1+S+ G2/M）的百分比，即细胞增生程度。
1.2.2 RT-PCR检测 收集RPE细胞，并将细胞数调至1×106/L，加入1mL Trizol，室温作用5min充分裂解，12 000r/min，10min离心后，2～8℃弃沉淀，加入（含200μL氯仿）1mL Trizol振荡混匀，室温静置15min，12 000r/min，15min，4℃离心，吸取水相层至另一离心管，加入（含0.5mL异丙醇）1mL Trizol振荡混匀，室温静置10min，12 000r/min，10min，4℃离心，弃上清，RNA沉于瓶底，Trizol 1mL中加入750mL/L乙醇，振荡摇匀，8 000r/min，5min，4℃离心，弃上清，室温晾干5～10min，50μL去离子水（DEPC处理），溶解样品，55～60℃，5～10min，测A值定量。按照Invitrogen RT-PCR试剂盒步骤进行RT-PCR。PI3K引物：上游：5'-ACT TTGTGACCTTCGGCTTT-3'，下游： 5'-TACATTCCTGATCTTCCTCG-3'；β-actin:上游：5'-GTTTGAGACCTTCAACACC-3'，下游：5'-GT GGCCATCT CCTGCTCGAAGTC-3'，引物扩增片段400bp。
1.2.3 Western-blot检测 收集细胞，PBS洗涤2次，裂解细胞收集蛋白上清液，加入2×加样缓冲液，煮沸5min。每个样品取40μg蛋白，进行120g/L SDS-PAGE电泳后，于180 mA 稳压状态下PVDF膜转印5h，以20g/L脱脂奶粉4℃封闭1h后，行Western-blot印迹，一抗为兔抗人PI3Kp110α单抗（1∶1 000）4℃过夜。含有1g/L Tween的PBS洗涤3次，每次5min。二抗为羊抗兔的辣根过氧化物标记的生物素化抗体（1∶5 000）室温作用1h，同上洗涤后，加入增强化学发光试剂，暗室中用高敏感X光胶片曝光显影。β-actin作为内参照（1∶500）重复上述步骤。
统计学处理：实验重复3次。利用SPSS 11.5统计分析软件，采用配对t检验比较各组之间细胞增生程度的差别。
2结果
2.1细胞增生指数 CoCl2建立RPE细胞缺氧后8，12和24h，处于S期的RPE细胞随着缺氧时间延长而增多，各时间点RPE细胞的增生指数均较基础状态（0h）明显升高（P＜0.05）。LY294002阻断剂处理组较对照组RPE细胞增生指数明显降低（P＜0.05，表1）。
2.2 PI3K mRNA表达 半定量RT-PCR检测结果表明，CoCl2缺氧前后培养的RPE细胞均有400bp目的条带PI3K mRNA的表达。而随缺氧时间的延长，目的基因表达强度逐渐增强（图1）。
2.3 PI3K蛋白表达 CoCl2建立RPE细胞缺氧即刻（0h），可见RPE细胞有少量磷酸化PI3K蛋白表达，说明人RPE细胞在基础情况下即有内源性的磷酸化PI3K蛋白的表达。加入200μmol/L CoCl2缺氧刺激后，磷酸化PI3K蛋白表达逐渐增强（图2）。
1：对照组；2：缺氧1h；3：缺氧4h；4：缺氧8h；5：缺氧12h；6：缺氧24h。a:PI3K；b：引物二聚体
图1 缺氧不同时间内RPE细胞磷酸化PI3K mRNA表达
1：对照组；2：缺氧1h；3：缺氧8h； 4：缺氧12h；5：缺氧24h
图2 缺氧后RPE细胞磷酸化PI3K蛋白表达
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