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3慢病毒载体的包装与纯化
目前慢病毒载体包装多采用人胚胎肾上皮细胞293T细胞系，它是由293细胞派生，同时表达SV40大T抗原，因此所有含有SV40复制起始点与启动子区的质粒均可以在293T细胞中复制、表达[15]。该细胞生长快，贴壁疏松，可通过多个质粒的磷酸钙共沉淀法或脂质体转染法转染，通过观察报告基因的表达水平确定其转染效率。慢病毒包装后面临的一个难题就是不易获得较高的病毒滴度，而病毒滴度是细胞转染成功的关键，因此不同的慢病毒纯化技术相继产生，有研究证明：通过低温超速离心纯化浓缩技术,可将慢病毒滴度提高至109～1010 TU/mL[16,17]；另外通过肝素亲合质谱法纯化VSVG包膜的慢病毒，可以得到53％的有感染性的病毒，同时去除94％的杂质[18]。另一方面有学者试用不同的包装细胞系来提高病毒产量，如293 EBNA1 cells（来源于293细胞，并表达EB病毒核抗原1）、293SFPacLV（来源于293SF细胞），采用无血清培养基悬浮培养，收集原液中病毒滴度可达106~1010TU/mL[19,20]。这些技术的发展都为慢病毒在临床的应用带来希望。
4慢病毒载体的生物安全性
因为慢病毒载体的转基因可在靶细胞持久地表达，其安全性也受到瞩目，其中最令人关注的是：在包装病毒时能否通过基因重组产生具有复制能力的逆转录病毒(replication competent retrovirus ,RCR) 。最新一代的慢病毒载体(第3 代)将HIV1 基因组中约60 %成分去除,因此父代病毒无法复制,载体本身只是将目的基因转移到靶细胞内的工具。而且利用逆转录机制构建自我失活(selfinactivating ,SIV)的HIV1 来源的载体,一旦转移到靶细胞后,它就丧失了病毒长末端重复的转录能力,减少了产生重组病毒的机会,并避免了与启动子干扰的问题[21,22]。以HIV1 为基础的第3代慢病毒载体系统的安全性甚至超过了目前临床试验正在使用的致癌性逆转录病毒载体。另外，越来越多的研究者关注如何使慢病毒载体携带的外源基因根据机体的需要进行有效调节，即一方面要求转基因处于无副作用的治疗剂量下恰当表达，另一方面要求通过人为的适时的中止表达，来达到治疗效果，且保证了治疗的安全性和可靠行，目前这种可调节的表达系统正在发展中，一些已经成功转入慢病毒载体系统，如应用最多、前景最好的四环素调节系统[23]。
5慢病毒载体在眼科应用的途径
目前慢病毒载体在眼科的应用途径主要为视网膜下间隙注射、玻璃体腔内注射、结膜下注射、前房注射等。眼后节疾病特别是视网膜疾病，主要采用视网膜下间隙注射途径，也有采用玻璃体腔内注射转染后的细胞如视网膜神经节细胞（retinal ganglion cell,RGC）和Müller细胞治疗外层视网膜疾病;另外几种途径主要用于眼前节疾病[18,2427]。
6慢病毒载体在眼科的应用领域
6.1慢病毒载体治疗遗传性视网膜变性性疾病
视网膜变性性疾病是一组遗传异质性视网膜病变，可由许多基因突变引起。这些疾病主要以光感受器细胞、色素上皮细胞进行性变性和凋亡为主要特征，现在逐渐上升为主要致盲病。猴免疫缺陷病毒来源的慢病毒被首次应用于转导色素上皮来源的因子（pigment epitheliumderived factor,PEDF）至RCS大鼠动物模型中，改善了视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium,RPE）细胞的神经营养功能，从而达到治疗目的，也证明了神经营养性基因治疗可以应用于视网膜色素变性（retinitis pigmentosa,RP）[28]。但是通过视网膜下腔注射的HIV、EIAV等来源的慢病毒载体主要在RPE表达，在视网膜内层细胞包括感光细胞和神经节细胞的表达非常局限。视网膜变性不仅仅涉及RPE的病变，同时还伴有光感受器的变性和凋亡，因此还需要关注光感受器的功能改善，而后者必须建立在对感光细胞高转染效率的基础之上。目前已证明启动子在转基因的特异性表达中发挥关键作用，通过更换或者插入特异性的启动子可以提高其在特定细胞的表达水平，如利用视紫红质启动子不仅可以使其在感光细胞特异表达，而且较巨细胞病毒（cytomegalovirus,CMV）启动子还能明显提高其表达水平[29]。Nicoud等[30]联合利用光感受器细胞特异性表达的启动子如光感受器间维甲酸结合蛋白（interphotoreceptor retinoidbinding protein,IRBP）增强子联合视紫红质Rhodopsin启动子或磷酸二酯酶启动子，证明EIAV能够在光感受器细胞专一强效表达。同时，也有许多学者关注于利用视网膜干细胞移植来治疗该类疾病，但是视网膜干细胞移植功能的重建一直是一个难题，其受到许多因素的影响，尤其是其移植后分化整合问题。目前慢病毒以它的安全有效长期稳定表达的优势逐渐成为干细胞转基因研究的焦点，已有许多研究将其应用于胚胎干细胞、造血干细胞等，通过体外基因修饰，调节特定基因的表达水平，提高干细胞移植的成功率，从而达到治疗疾病的目的，提示慢病毒载体有可能应用于视网膜干细胞的转基因治疗，为视网膜变性性疾病的治疗开辟新道路[3133]。
6.2慢病毒载体用于眼部新生血管性疾病
眼部新生血管可以发生在影响不同的组织，如视网膜、角膜。早产儿视网膜病变（retinopathy of prematurity,ROP）、年龄相关性黄斑变性(agerelated macular degeneration,AMD）、增殖型糖尿病视网膜病变（proliferative diabetic retinopathy,PDR）、视网膜血管阻塞性疾病等的病理改变各不相同，但是都具有病理性新生血管的共同点。虽然目前光动力学治疗、手术治疗等在一定程度上可延缓病情的发展，但是最终预后均不理想。随着基因组学和蛋白组学的发展，已发现许多启动和抑制血管发生的基因，如血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）、血管内皮抑素（Endostatin）和金属蛋白酶组织抑制剂1（tissue inhibitor of metalloproteinase1,TIMP1）等。动物体内实验发现：应用慢病毒载体能有效转导某些抗新生血管基因至眼部组织中，抑制新生血管的形成，而且这种基因治疗较其他抗新生血管治疗的方法更长效[34]。
6.3慢病毒载体在其他眼科疾病的应用
角膜移植后的排斥反应一直困扰着眼科医师，长期的药物治疗给患者带来了巨大的负担，因此希望通过基因治疗能够从根本上解决问题，但是一直未找到合适的载体。近来研究证明通过慢病毒转染，转基因可以在角膜内皮细胞较为长期且稳定表达，为角膜移植术后排斥反应的控制带来新的希望。研究发现玻璃体腔注射慢病毒在睫状体转染效率相对较低，而通过前房注射慢病毒，鼠类，猫动物模型及人的小梁网上都可以成功转导外源基因[35,36]。众所周知，小梁网与青光眼的治疗密切相关，控制着房水的排出，是调控眼压的重要因素，提示在今后的青光眼基因治疗中慢病毒载体可能成为一有利工具。另外，Cobrinik等[37]利用慢病毒载体来研究RB基因在视网膜母细胞瘤形成过程中的作用，为以后进一步探索视网膜母细胞瘤的发生机制及其基因治疗奠定了基础。
总之，慢病毒载体产生至今，随着生物工程技术的进步，其系统也在不断更新和优化，一方面提高了转染效率，另一方面又提高了其生物安全性，不断地渗透入眼科基因治疗的各个方面，但是在应用于临床之前，我们还将面临着许多工作，如进行大量的动物实验进行多方面、较长期的安全检测；对治疗性基因的表达进行恰当的调节等。希望通过不懈努力，慢病毒载体可以真正应用于临床眼科基因治疗中，为更多患者带来希望。
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