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葡萄膜炎患者外周血CD4+CD25high调节性T细胞表达

http://www.cnophol.com 2008-12-17 10:18:38 中华眼科在线

   【摘要】目的:通过检测葡萄膜炎患者外周血中CD4+CD25high调节性T细胞的表达水平,初步探讨其在葡萄膜炎发病中的作用。方法:取16例正常健康对照及30例不同类型活动期葡萄膜炎患者,采取抗凝外周血,进行三色免疫荧光染色、流式分析。结果:葡萄膜炎患者外周血中CD4+CD25high T细胞的百分率与正常健康对照(8.56%±4.22% vs 5.72%±3.11%)相比,显著升高(P=0.022),而且与患者病情严重程度明显相关(P=0.007)。另外CD4+CD25highCTLA4+T细胞在葡萄膜炎患者外周血中比例较正常对照明显升高(P=0.012)。结论:葡萄膜炎患者外周血中CD4+CD25high Treg细胞的异常表达可能参与疾病的发生发展,并与疾病的活动密切相关。

  关键词:葡萄膜炎;CD4+CD25high调节性T细胞;CTLA4

  引言
   
  CD4+CD25+ 调节性T细胞(CD4+CD25+ regulatory T cells,CD4+CD25+ Treg细胞)细胞是一群具有免疫抑制功能的T细胞。体内外实验均证实,该细胞具有抑制自身反应性T、B细胞的活化、增殖,免疫球蛋白分泌以及各种炎性细胞因子产生的作用。而越来越多的研究表明,CD4+CD25+ Treg细胞在自身免疫性疾病中发挥着重要的作用[1]。CD4+CD25+ T细胞又可分为CD4+CD25high T细胞和CD4+CD25low T细胞,在小鼠中,二类细胞都有免疫活性,而有人认为在人类外周血中起免疫抑制活性的是前者[2]。葡萄膜炎(uveitis)作为一组累及葡萄膜、视网膜、视网膜血管及玻璃体的器官特异性自身免疫病[3],迄今为止发病机制还尚不明确。近年来,发现在实验性自身免疫性葡萄膜视网膜炎(experimental autoimmune uveoretinitis,EAU)中CD4+CD25+ 调节性T细胞起到重要作用[4],而Treg细胞在葡萄膜炎患者中的表达及作用少有报道。因此,本实验拟通过检测不同病情程度葡萄膜炎患者外周血中CD4+CD25+ Treg细胞的表达水平,来探讨Treg细胞在葡萄膜炎发病过程中的作用,从而为今后进一步选择恰当的治疗葡萄膜炎的方法提供实验依据。

  1材料和方法

  1.1材料  PerCP标记的antiCD4单抗、APC标记的antiCD25单抗、PE标记的antiCTLA4 mAb (均购自美国BD Pharmingen公司),红细胞裂解液(美国BD公司),流式细胞仪(FACS calibur,美国BD公司)。

  1.2方法  选取活动期葡萄膜炎患者30例,全部病例均为20050901/20060330于第四军医大学西京医院医院眼科就诊的患者。其中男18例,女12例,年龄17~71(平均35.3)岁。所有患者均依据国际葡萄膜炎研究组的病因学分类标准进行诊断。其中全葡萄膜炎患者为9例,前葡萄膜炎患者8例,中后葡萄膜炎患者5例,后葡萄膜炎患者8例。正常对照为16例体检正常者,男10例,女8例,年龄20~55(平均34.2)岁。所有患者均按照以下疾病严重程度评分标准进行评分[5]:睫状充血(1分),房水细胞或房闪阳性(1分),角膜后沉着物(1分),虹膜粘连(1分),玻璃体有细胞或者视网膜病变(1分),计算总分。其中7例患者评分5分,6例为4分,4例为3分,7例为2分,6例为1分。免疫荧光染色流式分析:取正常对照或者患者抗凝外周静脉血2mL,取其中100μL,加入抗体FITC标记的antiCD4单抗,APC标记的antiCD25单抗及PE标记的antiCTLA4单抗各10μL,,阴性对照组加入荧光标志的相对应的同型抗体。室温避光反应30min,然后加入红细胞裂解液2mL,室温避光反应10min。1000rps/min离心10min后弃上清,用PBS重悬细胞,离心洗涤两遍后,用300μL PBS重悬细胞,上流式细胞仪检测,选取细胞总数为20000个,结果用cellquest软件分析。
   
  统计学处理:实验结果用SPSS for Windows软件分析,CD4+CD25high细胞及CD4+CD25highCTLA4+细胞在CD4+中表达用Students t检验,CD4+CD25high比例与患者病情严重程度的相关分析用spearman相关分析,均以P<0.05为差异显著性判定标准。

  2结果

  2.1 CD4+CD25high在CD4+中表达的比例  正常人及葡萄膜炎患者外周血中均能测到CD4+CD25highT细胞,CD4+CD25highT细胞所占的比例以其在CD4+T细胞中所占的百分比计算。各选取一例代表性的对照及患者流式结果图(图1)显示:葡萄膜炎患者外周血CD4+CD25highT比例较健康对照高。而统计分析显示, 处于病情活动的葡萄膜炎患者外周血中CD4+CD25high T细胞的百分率为8.56%±4.22%(n=30), 与正常健康对照(5.72±3.11%,n=16)相比,显著升高(P=0.022,图2)。

  2.2 CD4+CD25high比例与患者病情的相关分析  对30例活动期的葡萄膜炎患者CD4+CD25high T细胞比例与病情严重程度及血沉指标进行相关分析。依据前面所提的评分标准将病情严重程度进行评分。sprearman相关分析结果显示:葡萄膜炎患者CD4+CD25high T细胞比例与患者病情严重程度明显相关(图3,R=0.487,P=0.007),而与患者的血沉水平无明显相关性(P>0.05)。

  2.3 CD4+CD25high表达与不同葡萄膜炎类型分析  在我们选取的患者中,全葡萄膜炎患者为9例,前葡萄膜炎患者8例,中后及后葡萄膜炎患者共13例。CD4+CD25high在外周血CD4+细胞中表达显示:全葡萄膜炎患者为9.60%±3.93%,后及中后葡萄膜炎为8.11%±3.96%,前葡萄膜炎患者表达为 9.33%±5.01%,与所有外周血CD4+CD25high表达(8.56%±4.22%)相比,无显著性差异(P>0.05),三者之间也无显著性差异(P>0.05)。

  2.4 CD4+CD25highCTLA4+在CD4+中表达的比例  我们采用三色免疫荧光染色分析,研究了CD4+CD25highCTLA4+T细胞的表达比例。结果发现,正常人及葡萄膜炎患者外周血中均能测到CD4+CD25highCTLA4+T细胞,正常健康对照外周血中比例较低,为3.05%±1.90%,相比而言,葡萄膜炎患者外周血中比例升高,为4.97%±3.06%,两者相比有显著统计学差异(P=0.012)。

  图1  CD4+CD25high细胞在CD4+T细胞中表达流式图(R1: CD4+CD25highT 细胞  A: 1例正常健康对照,B:1例葡萄膜炎患者)(略)

  图2  对照及葡萄膜炎患者CD4+CD25high T细胞的比例(control:正常健康对照;uveitis patients:葡萄膜炎患者)(略)

  图3  葡萄膜炎患者CD4+CD25high T细胞比例与患者病情严重程度的相关分析(略)

  图 4  CD4+CD25highCTLA4+在CD4+中表达的比例(control:正常健康对照;uveitis patients:葡萄膜炎患者)(略)

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(来源:互联网)(责编:duzhanhui)

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