【摘要】目的：为研究碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）基因在人晶状体上皮细胞（human lens epithelial cell，HLEC）内表达情况。方法：采用原位杂交方法，用cDNA探针检测HLEC内bFGF mRNA的表达，并用图像分析进行相对定量。结果:HLEC内可检测到bFGF mRNA的表达。结论: HLEC内存在bFGF基因表达。
【关键词】 人晶状体上皮细胞；基因；原位杂交；碱性成纤维细胞生长因子；图像分析
Expression of basic fibroblast growth factor gene in human lens epithelial cell
YuFu Liu, HongWei Liu
Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University, Beijing 100730, China; Department of Pharmacology, Beijing Institute of Ophthalmology, Beijing 100005, China
Abstract
AIM: To study the expression of basic fibroblast growth factor（bFGF） gene in human lens epithelial cell(HLEC).
METHODS: The bFGF mRNA was detected with cDNA probe in HLEC using in situ hybridization. Relative quantitative analysis was done by image processing technique.
RESULTS: There was bFGF gene expression in HLEC by qualitative and quantitative analysis.
CONCLUSION: It is found that there is bFGF gene expression in HLEC. It is the material basis of postoperative posterior capsular opacification.
KEYWORDS: human lens epithelial cells; gene; in situ hybridization; bFGF; morphometry
0引言
后囊混浊的原因主要是由术后残留的晶状体上皮细胞(lens epithelial cell，LEC)增殖造成的，LEC的增殖原因为术后炎症刺激和损伤修复所致，细胞因子在这方面起重要作用。在人LEC中可检测到碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)蛋白[1]，同样在白内障LEC中也存在[2]。而bFGF可促进LEC的增殖和纤维化[3]，因此从基因表达方面对其进行研究，以探讨后囊混浊的发病机制。
1材料和方法
1.1材料 新鲜眼球，巩膜剪开后固定、脱水、石蜡包埋，取材3μm。硅化的盖玻片小块放在24孔培养板上，细胞悬液滴在其上，培养数日，取出盖玻片，中性树脂贴于载玻片上。术中取下的前囊片，其细胞面朝上贴于载玻片上，室温干燥，放于700g/L乙醇中。
1.2方法 bFGF cDNA探针全长1410bp，由军事医学科学院提供，采用地高辛标记cDNA探针进行实验。冰箱取出细胞爬片和囊膜片，复温5min，40g/L多聚甲醛溶液固定5min,用PBS洗3次,放入SSC中20min×2次。石蜡切片脱蜡入DEPC水，0.1mol/L PBS洗5min×2次，0.1mol/L HCL 10min, PBS 3min×2次, 10mg/L蛋白酶K消化（37℃）15min, 0.015mol/L甘氨酸中止消化，40g/L多聚甲醛固定10min，PBS液5min×2次(含DEPC)，三蒸水洗（含DEPC），乙醇脱水，干燥。42℃预杂交2h。原位杂交：每张切片加10μL杂交液（探针先于100℃变性5min，浓度不超过2mg/L），加塑料薄膜盖片，42℃作用18h。2次×SSC冲去盖片，2次×SSC（含2g/L SDS）洗，42℃ 15min，1次×SSC（含1g/L SDS）洗，42℃ 15min，0.2×SSC（含1g/L SDS）洗，42℃ 15min。缓冲液Ⅰ5min,缓冲液Ⅱ30min（封闭），缓冲液Ⅰ1min。加抗体缓冲液Ⅰ稀释抗体结合物（1∶5000）30min。缓冲液Ⅰ洗2次，各15min。缓冲液Ⅲ洗2min。显色：1mL缓冲液Ⅲ中加NBI4.5μL和BCIP3.5μL，显色30min。终止、脱水、封片。阳性细胞为蓝色或紫蓝色信号，阴性细胞无色或略呈浅红色。原位杂交所得出的阳性、阴性片，每张选出20～50个细胞做统计对象，使用Cambridge Quantimet 970型图像分析仪，用显微镜和摄像头输入图像，显微放大倍率为×1600，在此输入条件下，每个像点的标尺值为0.1695μm，校正显微标尺和阴影，将切片置于载物台上，调焦至清晰，测定细胞面积、平均光密度和积分光密度。
2结果
原位杂交结果表明：细胞爬片和石蜡切片（均为7mo胎儿）以及囊膜片（老年性白内障55岁）的晶状体上皮细胞均有bFGF的基因表达(图1)。图像分析结果表明：胎儿和老年人的晶状体上皮细胞bFGF的mRNA表达量较阴性对照组均有极显著性差异（表1）。
图1原位杂交晶状体上皮细胞bFGF的基因表达（×400） （略）
A:细胞爬片；B：石蜡切片；C：老年性白内障囊片
表1bFGF mRNA原位杂交图像分析（略）
3讨论
FGF能刺激细胞的增殖和分化。体内有多种细胞在使用外源性FGF后发生增殖。晶状体中央区LEC所储存和释放的FGF可能是对损伤增殖反应的基础。bFGF刺激LEC的增殖作用是与它的细胞表面的FGF受体相互作用得以实现的[4]。显然，细胞内的bFGF有可能被运输到细胞外部。已证明了bFGF基因不能编码垂直的信号肽序列，那么它是怎样到达细胞外面的还不清楚。明显的机制是细胞可能被溶解了；另外，bFGF与细胞外基质成分纤连蛋白的肝素硫酸盐、蛋白聚糖相结合，肝素硫酸盐生物合成基因变异影响 FGF与受体结合，可下调bFGF的作用[5,6]。一些物质可促进bFGF的生成，如IL1[7]。另外，应用反义技术可减少bFGF mRNA的表达，而抑制LEC增殖[8]。研究表明，bFGF对LEC的促增殖作用是通过MAPK/ERK信号系统而发挥作用的[9]。bFGF可促进粘着斑激酶的表达，可将细胞外基质的信号传入LEC中，以增强细胞的增殖和迁移作用[10]。
本实验研究表明：石蜡切片、细胞爬片和囊膜片的原位杂交，提示人LEC上有bFGF基因的表达，也就是证明了此细胞内存在bFGF，这为受到创伤刺激时释放到胞外发挥其生理作用提供了物质基础。因此，我们有理由推断后囊混浊的形成原因可能是在手术创伤后，发生了创伤修复反应，使已破坏或被刺激的LEC释放了bFGF，加之房水等眼中已存在的bFGF，达到一定浓度，与晶状体前囊残留缘或附近及沉落在后囊上的晶状体上皮细胞上的受体结合而发挥其促细胞增殖反应，使细胞向后囊上迁移、增殖、纤维化而最终成为后囊混浊发病的重要因素。
【参考文献】
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