【摘要】目的：建立体外RPE细胞损伤模型，观察损伤诱导的视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium, RPE）细胞移行以及MMP2和MMP9的表达。方法：在近铺满期视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium, RPE）细胞培养板上，采用角膜移植用的环钻和棉签法做圆形细胞刮伤区,SABC免疫组织化学方法检测RPE细胞受创后48h MMP2和MMP9的表达；并应用此损伤模型，计数进入缺损区的细胞数，观察地塞米松(Dex)对RPE细胞移行和对MMP2及MMP9表达的影响。结果：RPE细胞受创后损伤边缘的RPE细胞逐渐向缺损区移行；免疫组化结果显示,损伤后48h损伤边缘移行的RPE细胞呈MMP2的阳性表达，MMP9呈强阳性表达。Dex处理组中损伤诱导的RPE细胞移行明显减少，MMP2和MMP9的表达也明显减弱。结论：MMPs在RPE细胞移行修复中有重要意义，Dex可以通过抑制 MMP2和MMP9的表达而减少RPE细胞移行。
关键词：基质金属蛋白酶；视网膜色素上皮细胞；损伤模型；细胞移行；免疫组化
0引言
视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE) 细胞的移行是增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy,PVR)发生的重要环节［1,2］，如何减少细胞移行是研究的一个重点。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)参与降解细胞外基质(ECM)的多种蛋白成分，对细胞移行及ECM的重建起着重要作用。我们建立一种体外RPE细胞损伤模型，模拟PVR病程中RPE细胞的移行反应，观察损伤诱导的RPE细胞移行以及MMP2和MMP9 的表达，研究二者在RPE细胞损伤和PVR 发生中的作用。
1材料和方法
1.1材料 鼠抗人MMP2和MMP9抗体购自美国Nemarker公司，羊抗鼠IgG、链霉亲和素生物素复合物（SABC）免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒购自武汉博士德公司，丝裂霉素C（2mg）和地塞米松(Dex)为美国Sigma公司产品。取本实验室传代的人RPE细胞第4～7代用于实验［３］。用含100mL/L小牛血清的Dulbecco改良Eagle 培养基和Hams F12(DMEMF12)的混合完全培养基（青霉素100kU/L, 链霉素100kU/L），将RPE细胞以5×107/L的细胞密度接种于12孔培养板上，置于37℃、50mL/L CO2孵箱中培养48h。细胞近85%铺满后换用无血清DMEMF12培养基，使细胞静止24h。刮伤模型的建立采用角膜移植用的环钻（直径6.5mm），轻轻放在培养板上，从孔内伸入消毒棉签将环钻覆盖区内RPE细胞轻轻刮去，一个孔做2个刮伤区（图1A），DHanks液轻柔冲洗脱落细胞3次。更换新的无血清培养液，继续置于37℃、50mL/L CO2孵箱中培养。于损伤后48h弃培养液, 0.1mmol/L PBS浸洗3次，冰40g/L多聚甲醛固定30min，PBS洗2次，空气中干燥，20℃冰冻保存备用。一孔未做刮伤的细胞做对照组。
1.2方法 将培养板上已固定的RPE细胞，用PBS洗5min，5mL/L H2O2/甲醇室温处理30min,灭活内源性过氧化物酶；正常山羊血清封闭30min，吸取多余液体，不洗；滴加一抗，抗体滴度1∶100，湿盒内4℃过夜，复温后PBS洗涤3次,每次2min；滴加1∶100稀释生物素化羊抗鼠IgG，湿盒内37℃1h，PBS洗涤3次,每次2min；滴加SABC, 37℃30min，PBS洗涤4次，每次5min。显微镜下控制DAB显色时间，苏木素复染，脱水、透明、封片。具体步骤按照试剂盒说明进行，阴性对照用PBS代替鼠抗人MMP2和MMP9抗体。免疫组化结果以背景清晰、细胞质内淡黄色染色记为弱阳性，黄色为阳性，棕黄色染色为强阳性。每个标本观察5个视野。另将RPE细胞以5×107/L的细胞密度接种于12孔培养板上，置于37℃，50mL/L CO2孵箱中培养48h。细胞近铺满后在DMEMF12中加入丝裂霉素C（10mg/L）培养2h，以抑制细胞的增生能力。如前做细胞损伤模型，试验分2组，一组为损伤诱导的基础移行组，另一组加入1mg/L Dex。继续培养48h后，弃去培养液，40g/L多聚甲醛固定30min，HE染色，在100倍显微镜下每孔选择5个视野，计数越过刮痕线进入刮痕区的细胞数，每组设3个孔，实验重复3次。
统计学处理：两组之间移行能力的差别采用SPSS 10.0 统计软件独立样本的t检验分析处理。P<0.05 为差异有显著性意义。
2结果
2.1移行实验 损伤可以诱导RPE细胞移行，RPE细胞受创后损伤边缘的RPE细胞逐渐向缺损区移行（图1B）。基础移行组48h时平均移行细胞数为43.7±13.2，Dex 组平均移行细胞数为30.9±8.4，两组之间差异具有统计学意义（P=0.0026，P<0.05）。也就是 1mg/L Dex对损伤诱导的RPE细胞移行有抑制作用（图1C）。
图1 损伤模型诱导RPE细胞移行 （略）
A:融合RPE细胞刮伤即刻。可见中央无细胞区域，箭头所示弧线为刮痕线；B:刮伤48h后可见部分细胞移行进入刮伤区； C:Dex(1mg/L)作用组刮伤48h可见移入缺损区的RPE细胞数明显减少
2.2 MMPs表达 损伤后48h损伤边缘向缺损区移行的RPE细胞呈MMP2的阳性表达(图2A)，MMP9呈强阳性表达(图2B)；Dex处理组中移行的RPE细胞MMP2和MMP9均呈弱阳性表达（图2C）；未做刮伤的对照组MMP2染色为弱阳性，MMP9的表达为阴性。
图2 移行RPE细胞 MMPs表达（SABC×100）（略）
A:刮伤48h MMP2表达阳性； B:刮伤48h MMP9表达强阳性； C: Dex(1mg/L)作用组刮伤48h MMP9表达弱阳性
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