1 材料与方法
1.1 3T3成纤维饲细胞的准备
   取Swiss-3T3成纤维细胞系细胞（珠海东大实验室提供），接种于50ml培养瓶中，加入细胞培养基(GIBCO) (Hams F12与DMEM1：1混合)培养。待细胞融合达90%，0.25%胰蛋白酶-0.04%EDTA 5ml消化成细胞悬液，以1：2比例重新接种传代。3T3成纤维细胞培养到对数期（约为70%—80%），取6瓶3T3成纤维细胞加入含有4.0μg/ml丝裂霉素C的细胞培养液后，分别作用1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5小时，再加入新鲜培养液。24小时后，消化细胞以103个细胞/cm2接种于6孔板中。每2～3日换液一次。第2～12日，每日将3孔中的细胞消化，细胞计数取均值。
1.2 角膜缘干细胞克隆化培养及传代
   新西兰白兔角膜缘内外2mm取材；将组织切成1mm～2mm大小，加入DispaseⅡ酶[4]，置37℃、5％CO2恒温培养箱中消化3小时，再
加入0.25%胰蛋白酶(Difco)－0.04%EDTA常温下消化3～5分钟，稀释细胞为104个细胞/ml，取6块无菌6孔板（包括有盖玻片和无盖玻片两组），每孔各加1ml角膜缘干细胞稀释液（浓度为103个细胞/cm2）和1ml Swiss-3T3成纤维细胞稀释液（浓度为104个细胞/cm2），再补加1ml/孔培养液(Hams F12与DMEM的1：1混合物，20％胎牛血清)。接种48小时后，每日置显微镜下观察记录细胞贴壁情况， 每2～3天更换一次培养液，第4天开始每日记录克隆形成数，以每个细胞团超过4个细胞为1个克隆[5]。观察克隆生长情况，观察到细胞接种后第12日，细胞单层形成达80％时以0.04％EDTA去除Swiss-3T3成纤维细胞[6]，继续传代培养角膜缘干细胞。
1.3 克隆化角膜缘干细胞的冻存和复苏
   原代克隆化角膜缘干细胞消化成单个细胞后，常规方法冻存细胞[5]，采用二甲基亚砜为冻存剂，-80℃冻存细胞，复苏前准备好饲细胞，接种角膜缘干细胞，检测细胞的CFE。
1.4 克隆化角膜缘干细胞的增殖细胞核抗原（PCNA）染色
   克隆化培养第3、6、9天，选取生长于盖玻片的兔角膜缘干细胞克隆细胞团各2张；同时选取培养第4天的有饲细胞和无饲细胞的角膜缘干细胞各2张，以0.04%EDTA去除饲细胞。常规间接免疫荧光染色，一抗为鼠抗兔增殖细胞核抗原单克隆抗体PC10（Calbiochem公司），荧光素FITC标记二抗羊抗鼠IgG，封片后荧光镜检并照相记录。
1.5 统计学方法
   应用t检验、正态性检验等统计方法，设定P<0.05为有统计学差异。
2 结果
2.1 丝裂霉素C对Swiss-3T3成纤维细胞的影响
   经4.0ug/ml丝裂霉素C处理不同时间的3T3细胞，形态较均一，24小时可贴壁，但在培养期间，其增殖能力不同。其中，丝裂霉素处理2.5小时的3T3细胞，培养期间细胞的形态及数量无明显变化（图1～3）。

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